李 悅，于秀文

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

Ki-67是細胞增殖相關(guān)蛋白，其抗原的免疫組化檢測用于評估腫瘤增殖情況已經(jīng)多年。目前Ki67評估主要用于估計預(yù)后和指導(dǎo)輔助治療的選擇[1]，以及預(yù)測ER+/HER2-乳腺癌對新輔助治療的反應(yīng)和(或)最終的臨床結(jié)果[2，3]。因此，Ki-67增殖指數(shù)在乳腺癌治療方案的選擇和預(yù)后評估上起著越來越重要作用[4]，應(yīng)對所有乳腺浸潤性癌在化療前后進行Ki-67檢測，并對癌細胞中陽性染色細胞所占的百分比進行報告。但是Ki-67不僅在癌細胞中表達，還在一些增殖活性高的其他細胞，比如癌組織周圍浸潤的淋巴細胞中也有不同程度的表達。因此準確評估Ki-67的增殖指數(shù)相對較困難，尤其對于經(jīng)驗比較少的醫(yī)生來說就更為困難。本文應(yīng)用Ki-67與CK(廣)免疫組化雙重染色法探討乳腺癌中Ki-67增殖指數(shù)，為乳腺癌預(yù)后評估和指導(dǎo)輔助治療的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理選取黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心2016年1月-2018年8月經(jīng)手術(shù)切除的女性乳腺浸潤性癌(浸潤性導(dǎo)管癌)組織石蠟包埋標本103例，年齡34-69歲，平均年齡46.3歲，所有病例術(shù)前均未進行激素、化療等其它治療，每例組織內(nèi)含有不同數(shù)量的淋巴細胞。組織經(jīng)中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，裱在涂有10%多聚賴氨酸的載玻片上。所有病例與患者簽署知情同意書并經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會同意。

1.2 免疫組化試劑即用型鼠抗人CK(AE1/AE3)單克隆抗體(廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司)，即用型兔抗人Ki-67單克隆抗體(基因科技上海股份有限公司)，DouMaxVisionTM免疫組化雙染試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，二步法免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 實驗方法本實驗采用免疫組化雙重染色法，同時用免疫組化SP法進行對照，具體步驟按試劑盒說明書進行。組織切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗1次，EDTA(PH8.0)高壓修復(fù)2 min，PBS沖洗3 min×3次，3% H2O2室溫孵育10 min；PBS沖洗3 min×3次，動物非免疫血清室溫孵育15 min，甩干玻片；滴加一抗(Ki-67)50 μl 4℃過夜；PBS沖洗3 min×3次，滴加二抗(辣根過氧化物酶羊抗兔IgG聚合物)工作液50 μl，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；辣根過氧化物酶顯色試劑AEC顯色，顯微鏡下觀察顯色效果；蒸餾水沖洗5 min；滴加雙染增強劑10 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加一抗(CK AE1/AE3)50 μl 4℃ 過夜；PBS沖洗3 min×3次，滴加二抗(堿性磷酸酶標羊抗小鼠IgG聚合物)工作液50 μl，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；堿性磷酸酶顯色試劑BCIP/NBT顯色，顯微鏡下觀察顯色效果；自來水沖洗 5 min。蘇木素復(fù)染10 s，自來水沖洗返藍，AEC水性封片劑封片，中性樹膠封邊。Ki-67、CK(廣)免疫組化染色做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

所有切片采用盲法由兩位病理科醫(yī)生獨立閱片，CK(廣)蛋白定位于細胞質(zhì)，Ki-67定位于細胞核。隨機觀察10個高倍視野，每個視野記數(shù)100個細胞，根據(jù)Ki-67陽性細胞的比率進行評定。(1)按陽性細胞的比率評分：0分為陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)≤5%；1分為5%-20%；2分為21%-40%，3分為41%-60%，4分為60%以上。(2)按染色強度評分：0分為細胞無棕色顆粒與背景一致；1分為細胞出現(xiàn)弱棕色或棕黃色顆粒；2分為出現(xiàn)中等強度棕色或棕黃色顆粒；3分為出現(xiàn)強棕色或棕黃色顆粒。(3)總積分=陽性細胞的比率評分+染色強度評分：0分為陰性(-)；1-2分為弱陽性(1+)；3-5為陽性(2+)；6-7為強陽性(3+)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，Ki-67在兩組不同方法的表達采用χ2檢驗，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Ki-67陽性染色位于細胞核，表達于乳腺癌細胞及周圍浸潤的淋巴細胞中。CK(廣)定位于細胞質(zhì)，表達在上皮細胞即乳腺正常腺上皮細胞及乳腺癌細胞。免疫組化雙重染色Ki-67呈紅棕色，CK(廣)呈藍色，當兩者同時出現(xiàn)染色時即為雙重染色陽性，而對照組Ki-67及CK(廣)均呈棕黃色(圖1-3)。乳腺癌細胞免疫組化雙重染色與常規(guī)免疫組化染色相比，Ki-67比值“1+”增高，“3+”減少，經(jīng)χ2檢驗具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

圖1乳腺癌組織CK(廣)表達于癌細胞 圖2乳腺癌組織Ki-67表達于癌細胞圖3CK(廣)及Ki-67共表達 免疫組漿，SP法 放大200倍及淋巴細胞核，SP法放大200倍化雙重染色 放大200倍

表1 103例乳腺癌Ki-67常規(guī)免疫組化與免疫組化雙重染色比較

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，根據(jù)癌細胞ER、PR、Her-2、CK5/6蛋白的表達情況可分為不同的分子亞型[5]，每種亞型具有不同的預(yù)后及治療方法。Ki-67在預(yù)后的判斷及對新輔助化療的反應(yīng)上起到了一定的作用[6]，精準檢測Ki-67的比率顯得尤為重要。免疫組化雙重染色技術(shù)是在一張切片上同時顯示兩種抗原，此種方法定位清晰，對比明顯，易于觀察，避免反復(fù)切片，節(jié)約標本資源，尤其對于小的、珍貴的活檢組織，更是一種非常好的實驗方法[7]。

Ki-67與CK(廣)在腫瘤的診斷及鑒別診斷中是常用指標。Ki-67是一種增殖細胞相關(guān)核抗原，其陽性說明細胞增殖活躍，并提示腫瘤的惡性程度[8]。通常情況下，Ki-67百分比越高，惡性程度越高。但Ki-67在增殖活躍的細胞中都有表達，尤其是癌組織周圍浸潤的淋巴細胞，而Ki-67免疫組化單染色不能確定Ki-67表達的細胞是否是腫瘤細胞，給Ki-67的判斷帶來了不準確性。CK(廣)主要分布于上皮細胞，是角質(zhì)細胞的主要骨架蛋白，其主要功能是維持上皮組織的完整性及連續(xù)性[9]。CK陽性表達見于上皮細胞、間皮細胞、癌、間皮瘤等。Ki-67與CK在同一組織分別進行免疫組化單染色，雖然也能觀察出腫瘤細胞的增殖情況，但是定位比較費力，不能準確地計算出Ki-67的百分比。本文在同一張切片中進行Ki-67與CK雙重染色，用CK標記出癌細胞，在此基礎(chǔ)上觀察Ki-67的表達，起到了直觀、定位準確，對比清晰的作用。并且用兩種染色比較乳腺癌細胞Ki-67表達結(jié)果表明，免疫組化雙重染色比免疫組化單染色Ki-67比值“1+”增高，“3+”減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示免疫組化雙重染色更能準確判斷腫瘤細胞中Ki-67的表達情況，尤其對于乳腺癌應(yīng)用新輔助化療前的病人，穿刺標本應(yīng)用此種方法可節(jié)約標本，對比清晰，對于判斷Ki-67的表達情況具有更大的幫助。