王硯硯,樸蓮淑,楊子榮,張 孟,于慶功

(大連大學附屬中山醫(yī)院 消化內(nèi)科,遼寧 大連116001)

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,流行病學調(diào)查顯示,全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居常見惡性腫瘤第5位,病死率第3位[1]。因其早期癥狀隱匿,進展迅速,惡性程度高,大多數(shù)患者確診時已處于中晚期,同時大多伴有局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移,往往預(yù)后不佳。因此,深入探討肝癌發(fā)生發(fā)展機制,尋找肝細胞癌惡性增殖及轉(zhuǎn)移治療干預(yù)靶點已成為近期研究熱點。14-3-3蛋白家族為高度保守性蛋白,參與各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,本研究采用免疫組織化學法檢測HCC癌組織和癌旁組織14-3-3 zeta蛋白表達情況,并對其與腫瘤臨床病理特征進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2012年1月至2018年12月在大連大學附屬中山醫(yī)院診治的手術(shù)后肝細胞肝癌組織標本72例,其中男47例,女25例,年齡37-73歲,平均52歲。所有患者診斷標準均參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》的標準。排除標準：(1)術(shù)前有化療、放療以及免疫治療者；(2)未經(jīng)病理學檢查證實的患者；(3)繼發(fā)性肝癌；(4)合并有其他器官惡性腫瘤；(5)伴有免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 肝組織14-3-3 zeta蛋白檢測應(yīng)用免疫組織化學染色法,將所有組織標本(包含腫瘤組織和癌旁組織)經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片,厚度約為5 μm。將兔抗人14-3-3 zeta 多克隆抗體(Abcam公司,英國)稀釋度為1∶200,作為一抗,染色試劑盒為中杉金橋超敏型PV-9000試劑盒,按試劑說明書進行。

1.3 結(jié)果的判定兼顧腫瘤陽性細胞百分率和腫瘤陽性細胞染色強度,對免疫組織化學染色結(jié)果進行判定。腫瘤陽性細胞百分率評分:0分(<5%)、1分(5%-25%)、2分(26%-50%)、3分(51%-75%)、4分(>75%)。染色強度評分：0分(無染色),1分(輕度染色,即淺黃色),2分(中度染色,即棕黃色),3分(強染色,即黃褐色)；免疫組化評分=腫瘤陽性細胞百分率×染色強度。對免疫組化染色進行評分：0-0.5分計為0分,0.5-1.5分計為1分,1.5-2.5分計為2分,>2.5分計為3分,并且：0分(-),1分(+),2分(++),3分(+++)；(-)和(+)為陰性,(++)和(+++)為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌患者肝組織14-3-3 zeta 蛋白表達情況經(jīng)免疫組織化學染色后,14-3-3 zeta蛋白在HCC組織和癌旁組織中均有表達,且HCC組織(61.1%,44/72)中表達的陽性率顯著高于癌旁組織(12.5%,9/72),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=34.51,P=0.00)，如圖1。

注：A為癌組織；B為癌旁組織

2.2 14-3-3 zeta 蛋白表達陽性率與腫瘤臨床病理特征如表1所顯示,14-3-3 zeta 蛋白在腫瘤組織學分級Ⅲ級和Ⅳ級、術(shù)前AFP >400 ng/ml、發(fā)生血管浸潤的癌組織中表達陽性率分別為80.0%、79.5%、82.6%,顯著高于組織學分級Ⅰ級和Ⅱ級、術(shù)前AFP≤400 ng/ml以及未發(fā)生血管浸潤的癌組織(53.1%、48.5%、55.1%),兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其表達水平與有無包膜、病灶大小無相關(guān)性。

3 討論

14-3-3蛋白家族是一個高度保守的酸性多肽家族,其過表達有助于各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。該蛋白家族中重要成員之一14-3-3 zeta,主要以同源/異源二聚體形式存在,參與調(diào)節(jié)細胞周期、有絲分裂、凋亡和侵襲等多個細胞過程[2]。既往研究中已經(jīng)被證實其在食管癌、乳腺癌中表達顯著升高。同時,本實驗也通過對免疫組織化學染色結(jié)果進行分析,HCC患者癌組織中14-3-3 zeta蛋白的表達陽性率明顯上升,顯著高于癌旁肝組織,差異較為明顯,提示14-3-3 zeta蛋白的高表達均能夠影響到HCC 的發(fā)生過程。有研究者認為,14-3-3 zeta在通過激活JNK和p38/MAPK信號通路調(diào)控HCC細胞增殖,降低14-3-3 zeta 表達可以提高化療敏感性[3]。同時,14-3-3 zeta在肝癌細胞凋亡中也扮演重要角色。過表達的14-3-3 zeta與ASK1特異位點結(jié)合并相互作用,抑制了ASK1介導(dǎo)的肝細胞凋亡。若阻斷二者的特異結(jié)合,則可增強ASK1介導(dǎo)的肝癌細胞凋亡[4]。

表1 癌組織14-3-3 zeta 蛋白表達陽性率(%)與腫瘤臨床病理特征分析

唐裕福[5]等研究發(fā)現(xiàn),14-3-3 zeta的表達與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、微血管侵襲、門靜脈癌栓、遠處轉(zhuǎn)移、早期復(fù)發(fā)及腫瘤TNM分期等惡性病理特征密切相關(guān),提示14-3-3 zeta可能與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本研究中,對比不同的臨床病理學特征分析發(fā)現(xiàn),癌組織14-3-3 zeta蛋白在組織學分級較差、合并血管浸潤以及術(shù)前血清AFP水平較高的HCC患者中表達陽性率明顯上調(diào)。復(fù)習相關(guān)研究認為：(1)肝癌細胞中14-3-3 zeta上調(diào)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子snail和tiwst的表達,抑制了E-cadherin的表達,即通過調(diào)控上皮間質(zhì)化(EMT)的進程來促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移,與腫瘤分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)[6]。(2)14-3-3 zeta 表達增加與術(shù)前血清AFP升高在輔助診斷原發(fā)性肝癌中具有一致性,提示14-3-3 zeta將可能成為未來早期診斷和篩查肝細胞性肝癌的新生標志物[7]。(3)在腫瘤細胞的侵襲過程中,腫瘤周圍基質(zhì)的降解由金屬基質(zhì)酶(MMPs)調(diào)控,血管的生成則由血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)調(diào)控,而14-3-3 zeta 調(diào)控著二者的表達。但本研究并未發(fā)現(xiàn) 14-3-3 zeta蛋白的表達與肝癌組織包膜浸潤及腫瘤病灶大小的關(guān)系,這與王愷等的研究結(jié)果不一致,分析其原因可能14-3-3 zeta主要參與肝癌免疫反應(yīng)有關(guān)[8,9]。

14-3-3蛋白可與多種蛋白結(jié)合,參與了細胞內(nèi)廣泛的生物學事件調(diào)控過程,探索14-3-3 zeta在惡性腫瘤中的凋亡調(diào)控作用,有望為肝細胞癌的生物學治療提供新的思路[10]。