陳立杰，楊 霞，高 倩，李 悅，陳 紅

（1. 貴州大學(xué) 校辦產(chǎn)業(yè)總公司，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué) 科技學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

貴州是世界茶樹原產(chǎn)地之一，有著豐富的茶樹資源。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴陽市花溪區(qū)的久安、高坡等鄉(xiāng)鎮(zhèn)有數(shù)百棵古茶樹資源，古茶樹因其進(jìn)化上的原始性、極強(qiáng)的抗逆性、豐富的遺傳基因，成為研究茶樹起源、演化和分類的重要材料和依據(jù)。為了加強(qiáng)對(duì)古茶樹資源的保護(hù)和開發(fā)利用，可對(duì)花溪優(yōu)良古茶樹進(jìn)行離體快速繁殖。對(duì)茶樹的組織培養(yǎng)，既可用于大量生產(chǎn)優(yōu)良無性系植株，又可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等障礙，對(duì)于開展茶樹種質(zhì)資源的保存、新品種的培育及種性改良等具有重要意義。因此，本研究以花溪古茶樹為試驗(yàn)材料，初步探討并建立其組培快繁體系，為花溪古茶樹資源的保存及推廣利用提供材料和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為貴州省貴陽市花溪區(qū)高坡鄉(xiāng)、久安鄉(xiāng)的古茶樹。其中高坡喬木型古茶樹4個(gè)單株代號(hào)分別為HGL、HJ（J）、HGK、HGN；久安灌木型古茶樹4個(gè)單株代號(hào)分別為U、10301、06721、20298。試驗(yàn)均選取古茶樹優(yōu)良單株帶芽莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花溪古茶樹外植體滅菌時(shí)間篩選選取久安灌木型花溪古茶樹當(dāng)年生幼嫩枝梢，去除葉片后保留小段葉柄，然后將其用流水沖洗2 h，將沖洗過的久安灌木型古茶樹單株10301用0.1% HgCl2分別消毒4、6、8 min，找到最佳消毒時(shí)間。將2種類型花溪古茶樹8個(gè)單株均以最佳消毒時(shí)間進(jìn)行消毒后，用無菌水沖洗5次，切取1 cm長(zhǎng)的莖段作為外植體。7 d后觀察并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算污染率、褐變率及存活率。比較最佳消毒時(shí)間下，不同品種花溪古茶樹莖段的差異，找到成活率最高的花溪古茶樹單株。

1.2.2 6-芐基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）配比試驗(yàn)選取1.2.1中所得成活率最高的花溪古茶樹單株無菌莖段為代表，接種于添加有不同質(zhì)量濃度6-BA（0、0.5、1、1.5、2 mg/L）和NAA（0、0.1、0.2、0.5、1 mg/L）組合的MS培養(yǎng)中，40 d后觀察統(tǒng)計(jì)各處理組培苗萌發(fā)生長(zhǎng)情況、增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)基篩選將1.2.2中生長(zhǎng)健壯的芽苗接種到附加有2 mg/L活性炭以及不同質(zhì)量濃度的吲哚丁酸（IBA）（0.5、1、2 mg/L）和NAA（0.1、0.5、1 mg/L）的1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。40 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光周期為14 h/d，光照強(qiáng)度約為2 000 lx。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)花溪古茶樹莖段的影響

由表1可知，不同消毒時(shí)間對(duì)久安灌木型古茶樹單株10301莖段的污染率、褐變率、成活率影響差異顯著。隨著消毒時(shí)間的增加，污染率逐漸降低，成活率逐漸增加，但褐變率整體也隨之增加。綜合考慮污染率、褐變率和成活率，以0.1% HgCl2消毒6 min為宜，此時(shí)花溪古茶樹單株10301莖段的污染率、褐變率及成活率分別為25.7%、20.0%及52.3%。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)花溪古茶樹莖段的影響

2.2 同一消毒時(shí)間對(duì)不同品種花溪古茶樹莖段消毒效果的影響

由表2可知，采用0.1% HgCl2消毒6 min時(shí)，高坡喬木型古茶樹4個(gè)單株中成活率最高的為HGN，其成活率可達(dá)60.0%；久安灌木型古茶樹4個(gè)單株中褐變率均比高坡喬木型古茶樹低，成活率也較高，其中最高的是單株10301，存活率為73.3%。

表2 同一消毒時(shí)間對(duì)不同品種花溪古茶樹莖段的影響

2.3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)花溪古茶樹萌發(fā)生長(zhǎng)及增殖的影響

由圖1可知，不添加任何生長(zhǎng)劑的培養(yǎng)基中，久安灌木型古茶樹單株10301莖段幾乎無變化，但添加生長(zhǎng)劑培養(yǎng)基中的莖段均產(chǎn)生一定變化，表明激素配比對(duì)茶樹莖段萌發(fā)生長(zhǎng)及增殖有明顯的影響。由表3可知，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)劑可使久安灌木型古茶樹單株10301莖段的增殖系數(shù)增高，其中變化最明顯的為處理6（6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L），其培養(yǎng)基中久安灌木型古茶樹單株10301莖段長(zhǎng)勢(shì)好，粗壯，增殖系數(shù)最大（1.5）。雖然處理7（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）的培養(yǎng)基中久安灌木型古茶樹單株10301莖段生長(zhǎng)也相對(duì)較好，但綜合增殖及生長(zhǎng)情況，最適宜花溪古茶樹莖段萌發(fā)生長(zhǎng)及增殖的培養(yǎng)基組成為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)花溪古茶樹莖段萌發(fā)的影響

表3 不同6-BA和NAA質(zhì)量濃度培養(yǎng)基組合對(duì)花溪古茶樹生長(zhǎng)及增殖的影響

2.4 不同培養(yǎng)基組合對(duì)花溪古茶樹生根的影響

當(dāng)久安灌木型古茶樹單株10301莖段的不定芽長(zhǎng)至2 cm以上時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯的試管苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根。由表4可知，IBA和NAA質(zhì)量濃度過高或過低組合的培養(yǎng)中，花溪古茶樹生根率均較低，培養(yǎng)基組成為1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的生根率最高（56.7%），此時(shí)苗株粗壯，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖2），與其他處理存在顯著差異。

表4 不同IBA和NAA質(zhì)量濃度培養(yǎng)基組合對(duì)花溪古茶樹生根的影響

圖2 培養(yǎng)基組成為 1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA 的花溪古茶樹苗株時(shí)生長(zhǎng)狀況

3 結(jié)論與討論

一般情況下，茶樹組織的培養(yǎng)常采用75%酒精與0.1% HgCl2進(jìn)行消毒。但在本試驗(yàn)前期的消毒處理中發(fā)現(xiàn)，酒精會(huì)增加花溪古茶樹幼嫩莖段的褐變率。此外，有研究表明，植株的外植體木質(zhì)化的程度越高，越不容易進(jìn)行消毒，莖段所受的污染越嚴(yán)重。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，以0.1% HgCl2消毒6 min為宜，此時(shí)花溪古茶樹單株10301莖段的污染率、褐變率及成活率分別為25.7%、20.0%及52.3%，但仍不是理想狀態(tài)，因此后期還需進(jìn)一步對(duì)花溪古茶樹離體培養(yǎng)的消毒方式進(jìn)行探討。

在花溪古茶樹莖段的萌發(fā)增殖培養(yǎng)中，生長(zhǎng)劑含量的增加對(duì)莖段生長(zhǎng)及增殖有一定促進(jìn)作用，但超過一定范圍后，會(huì)抑制莖段的萌發(fā)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)所得最優(yōu)的培養(yǎng)基組成為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，此時(shí)花溪古茶樹的莖段芽苗粗壯，長(zhǎng)勢(shì)好，但增殖系數(shù)偏低，因此還有待對(duì)花溪古茶樹增殖培養(yǎng)基作進(jìn)一步優(yōu)化。

此外，由于花溪古茶樹喬木和灌木2種類型的優(yōu)良單株較多，本試驗(yàn)中僅對(duì)個(gè)別優(yōu)勢(shì)單株進(jìn)行離體繁殖，因此，為了更好的保護(hù)和利用花溪古茶樹優(yōu)良資源，還需對(duì)不同花溪古茶樹離體繁殖技術(shù)體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。