王 晶，張 川，栗 意，任金妹，唐扣明

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院藥劑科，上海 201700；2.上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200003；3.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院，上海 201318)

根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告(2017)》報(bào)道，因心血管病死亡人數(shù)占因疾病死亡的40%以上，高于腫瘤及其他疾病，成為導(dǎo)致人類死亡的首位疾病。盡管近年來(lái)心血管疾病的防治工作已經(jīng)取得了初步成效，但是心血管病的患病率和病死率仍呈上升趨勢(shì)，醫(yī)療工作者面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。丹參是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。性微苦，微寒，歸心、肝經(jīng)。具有活血通經(jīng)，祛瘀止痛，清心除煩，養(yǎng)血安神的功效，在我國(guó)已被廣泛用于治療心血管疾病和腦血管疾病[2]。丹參素是丹參的水溶性活性成分之一，具有抗心肌缺血及缺氧[3]、抗心肌缺血再灌注損傷[4]、擴(kuò)張冠脈[5]、抗心肌肥大[6]、抗心律失常[7]、抗血栓[8]等多種藥理作用，對(duì)心血管系統(tǒng)具有明顯的保護(hù)作用[9]。前期研究表明，丹參素鈉在SD大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度僅為9.84%，作為口服制劑，存在生物利用度低、吸收較差的問(wèn)題。因此，提高丹參口服類制劑的生物利用度研究勢(shì)在必行。

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層排列而成的納米微囊，具有親水和疏水能力的新型藥物載體。因具有溶解度高、穩(wěn)定性好[10]，并具有促進(jìn)藥物靶向、增強(qiáng)治療效果[11]以及提高生物利用度[12-13]等優(yōu)勢(shì)，被作為藥物載體廣泛應(yīng)用。

筆者對(duì)丹參素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，制成脂溶性更高的前藥丹參素棕櫚醇酯(PDSS)，能更大程度地提高脂質(zhì)體對(duì)藥物的包封率，在體內(nèi)廣泛存在的酯酶作用下轉(zhuǎn)化為丹參素，進(jìn)一步發(fā)揮藥理活性。同時(shí)，提高丹參素的生物利用度，為進(jìn)一步開發(fā)口服制劑提供參考和依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用逆向蒸發(fā)法制備PDSS脂質(zhì)體，應(yīng)用HPLC法建立PDSS的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行含量測(cè)定，為丹參素脂質(zhì)體的進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀( 美國(guó)安捷倫科技有限公司)；BS124S電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；SK5210HP水浴超聲儀(上海KUDOS超聲儀器有限公司)；NANO-S粒徑儀(英國(guó)Malvern公司)；TGL-16C離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；Mili-QUFPLUS純水儀(美國(guó)Milipore公司)；微孔濾膜(規(guī)格：0.45 μm和0.22 μm)。

1.2 藥品與試劑

丹參素對(duì)照品(純度99.6%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；丹參素原料藥(批號(hào)：150801，純度>99%)；PDSS(自制，純度>95%)；膽固醇(含量>98%，上海海捷生物科技有限公司)；大豆卵磷脂(含量>97%，上海海捷生物科技有限公司)；色譜純甲醇、乙腈(德國(guó)默克公司)；三乙胺、甲酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PBS緩沖液為自制，水為去離子水。

2 PDSS脂質(zhì)體的制備

精密稱取膽固醇5.75 mg，大豆卵磷脂16.79 mg和PDSS 3.16 mg，置于250 ml的圓底燒瓶中，加入20 ml氯仿超聲至完全溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中(轉(zhuǎn)速 100 r/min，水浴溫度45 ℃)，旋蒸1 h除去氯仿，在圓底燒瓶上形成均勻薄膜，加入4 ml去離子水，非真空旋蒸30 min(轉(zhuǎn)速 60 r/min，水浴溫度為45 ℃)，迅速冰浴超聲處理(超聲時(shí)間1 min)，分別用0.45、0.22 μm微孔濾膜各過(guò)濾3次，得到PDSS脂質(zhì)體溶液，于4 ℃保存。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(50:50)含0.02%甲酸和0.02%三乙胺水(pH為6～7)；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。在上述色譜條件下，PDSS峰的理論塔板數(shù)為10 000以上，分離度>1.5。

3.2 溶液的配制

3.2.1空白脂質(zhì)體溶液

按照處方比例稱取大豆卵磷脂、膽固醇，按照“2”項(xiàng)下方法制備不加入PDSS的空白脂質(zhì)體，去離子水破乳，得到空白脂質(zhì)體溶液。

3.2.2對(duì)照品溶液

精密稱取PDSS對(duì)照品1 mg，用約1 ml流動(dòng)相溶解，配制與脂質(zhì)體溶液等濃度的溶液，過(guò)膜后取100 μl加入900 μl流動(dòng)相，離心，取上清液進(jìn)樣。

3.2.3供試品溶液

精密量取PDSS脂質(zhì)體100 μl，加入900 μl流動(dòng)相，水浴超聲30 min，離心，取上清液進(jìn)樣分析。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1專屬性試驗(yàn)

取PDSS對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照上述色譜條件注入液相色譜儀；另取處方量輔料，置于EP管中，按照擬定方法制備空白對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，分別記錄HPLC圖(圖1)，考察系統(tǒng)適用性。結(jié)果表明，在該色譜條件下，輔料對(duì)PDSS的測(cè)定無(wú)干擾。

3.3.2線性關(guān)系考察

分別精密移取0.5、1.5、2.5、3.5、4.0、4.5 ml 上述對(duì)照品溶液置10 ml 棕色量瓶中，用流動(dòng)相定容。用微孔濾膜過(guò)濾后，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以PDSS峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程(n=6)：Y=82.2108X-0.6560(r=0.9997)，線性范圍為0.05～0.45 mg/ml。結(jié)果表明PDSS在質(zhì)量濃度0.05～0.45 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

取適量的PDSS脂質(zhì)體，按照“3.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。PDSS平均含量為0.2821 mg/ml，RSD為0.58%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.3.4精密度試驗(yàn)

精密移取“3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.25、0.45 mg/ml的溶液，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。連續(xù)5 d的6份樣本分析，考察日內(nèi)、日間精密度。低、中、高3個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為1.58%、1.13%、1.56%；日間精密度分別為1.16%、1.54%、1.83%。結(jié)果顯示，PDSS峰面積的RSD均<2%，符合定量測(cè)定要求。

圖1 丹參素棕櫚醇酯HPLC圖 A.空白對(duì)照溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.丹參素棕櫚醇酯(PDSS)

3.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次(批號(hào)：20181215-1)對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，其RSD分別為0.26%和1.32%，結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

3.3.6加樣回收率試驗(yàn)

精密量取空白脂質(zhì)體溶液100 μl共9份，置于10 ml量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為1 mg/ml的PDSS對(duì)照品儲(chǔ)備液100、500、900 μl各3份，用乙腈定容至刻度，搖勻，水浴超聲 30 min，超速離心10 min， 取上清液進(jìn)樣分析。結(jié)果見表 1。

表1 PDSS脂質(zhì)體的回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 樣品含量測(cè)定

按照“2”項(xiàng)下方法制備PDSS脂質(zhì)體3批(批號(hào)：20181215-1、20181215-2、20181215-3)，按照建立的HPLC方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖，以PDSS峰面積按照外標(biāo)法計(jì)算3批樣品的含量。結(jié)果顯示，3批樣品含量分別為97.81%、101.20%、98.53%，RSD為1.2%。

3.5 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

精密量取1 ml的脂質(zhì)體溶液，采用低溫超速離心法，在4℃條件下，以3 500 r/min，離心10 min，精密稱取超濾管下層溶液100 μl，測(cè)得游離藥物含量為W1，另外精密移取PDSS溶液100 μl加入900 μl乙腈并且超聲破乳，測(cè)定藥物含量為W2，包封率(EE)計(jì)算公式為：EE(%)=(W2-W1)/W2×100%。結(jié)果測(cè)得PDSS脂質(zhì)體的平均包封率為77.2%。

4 討論

本研究建立了丹參素棕櫚醇酯脂質(zhì)體含量和包封率測(cè)定的HPLC方法。藥物的水溶性通常作為參數(shù)用以預(yù)測(cè)藥物吸收率和口服生物利用度。丹參素為水溶性成分，親脂性差、口服吸收差，導(dǎo)致生物利用度低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)丹參素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，制成親脂性前藥，以提高丹參素的口服生物利用度。

4.1 流動(dòng)相的選擇

PDSS為脂溶性藥物，極性較小，不溶于水，而易溶于甲醇、乙醇、乙腈、DMSO等有機(jī)溶劑。選擇流動(dòng)相時(shí)，曾選用甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-甲酸[13]等體系作為流動(dòng)相，流速為1 ml/min。在甲醇-0.1%冰醋酸水體系中，多次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)PDSS與雜質(zhì)不能基線分離。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動(dòng)相即可實(shí)現(xiàn)化合物和溶劑峰良好的分離，輔料對(duì)于PDSS脂質(zhì)體的含量測(cè)定無(wú)干擾，能夠滿足檢測(cè)要求。在乙腈-甲酸-水體系中，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整流動(dòng)相比例，得出乙腈-水(含0.05%三乙胺和0.05%甲酸)(50∶50)為流動(dòng)相。PDSS化合物的出峰時(shí)間為11.587 min，且輔料對(duì)PDSS化合物的峰值無(wú)干擾。

4.2 包封率測(cè)定方法的選擇

測(cè)定脂質(zhì)體包封率的方法有凝膠柱層析法、陽(yáng)離子交換樹脂法、超濾膜過(guò)濾法、透析法、低速離心法、逆向蒸發(fā)法等。其目的主要是有效分離脂質(zhì)體和游離藥物，常用的是葡聚糖凝膠柱法與離心法，但是葡聚糖凝膠法中凝膠會(huì)吸附脂質(zhì)體，導(dǎo)致柱回收率較低，并且操作煩瑣、洗脫體積大、藥物濃度低，不適用于PDSS包封率的測(cè)定。而低速離心法適用于溶解度小的藥物且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其可用于PDSS脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法操作簡(jiǎn)便、快捷，專屬性、回收率以及重復(fù)性均符合要求，能用于測(cè)定PDSS脂質(zhì)體中PDSS成分的含量。