陸東濤，劉 超，秦路平，鄒 燕

(海軍軍醫(yī)大學(xué)：a.長(zhǎng)海醫(yī)院藥材科,b.藥學(xué)院，上海 200433)

海洋天然產(chǎn)物因有其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好的生物活性，許多課題組都致力于從其中尋找具有潛在藥理活性的先導(dǎo)化合物，迄今為止，許多化合物已經(jīng)成為藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-2]。在海洋天然產(chǎn)物中，環(huán)肽是有著獨(dú)特藥理活性和生物化學(xué)特性的一類化合物[3-4]。這類化合物因其特殊的穩(wěn)定性和選擇性，能夠有效地模仿蛋白表位來(lái)干擾蛋白-蛋白間相互作用，體現(xiàn)出較高的臨床治療價(jià)值[5]。與傳統(tǒng)直鏈肽相比，環(huán)肽類化合物具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、脂溶性高、穿膜性強(qiáng)、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[6-8]，使其在抗結(jié)核[9]、抗菌[10]、抗病毒[11-12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14-15]等藥物的研發(fā)中發(fā)揮著無(wú)可替代的重要作用。

Stylissamide是從Stylissa屬海綿中分離得到的一類富含脯氨酸殘基的環(huán)肽化合物，自2007年Schmidt等[16]從Stylissacaribica中分離得到stylissamide A以來(lái)，已經(jīng)先后從該屬海綿中得到一系列類似環(huán)肽化合物，該系列環(huán)肽表現(xiàn)出抗腫瘤和抗菌等多種生理活性[17-18]。Stylissamide Ⅰ是由Kubota等[19]從日本沖繩海綿Stylissasp.樣品中提取純化得到的環(huán)七肽化合物，經(jīng)過(guò)高分辨電噴霧質(zhì)譜以及二維核磁等技術(shù)表征，明確其序列為Cyclo-(Pro-Pro-Val-Pro-Tyr-Tyr-Tyr)，結(jié)構(gòu)如圖1所示。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，stylissamide Ⅰ對(duì)Aspergillusniger顯示出較好的抑制活性，是具有開(kāi)發(fā)前景的抗真菌藥物先導(dǎo)化合物。然而，單純依靠從天然產(chǎn)物中分離純化得到stylissamide Ⅰ很難滿足對(duì)其藥理活性和構(gòu)效關(guān)系等進(jìn)一步研究的需要，并且也無(wú)法對(duì)其開(kāi)展結(jié)構(gòu)優(yōu)化和修飾等研究。因此，一種高效簡(jiǎn)便的全合成方法是十分必要的。

以往對(duì)類似環(huán)肽化合物的固相合成/液相環(huán)合研究中，通常使用1-羥基苯并三唑(HOBt)/N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)作為縮合劑完成直鏈多肽的固相合成[20-21]。該方法氨基酸偶聯(lián)形成酰胺鍵所需反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(2～4 h)，并且在縮合過(guò)程中DIC所形成的副產(chǎn)物N,N-二異丙基脲溶解性差，需要使用大量有機(jī)試劑沖洗樹(shù)脂，后處理煩瑣。本研究基于課題組前期研究成果，以二氯樹(shù)脂為固相載體，通過(guò)縮合劑DIPEA/HCTU依次連接Fmoc/tBu保護(hù)的氨基酸，完成多肽的固相合成[22]；隨后在三氟乙醇的條件下將直鏈肽從樹(shù)脂上切割下來(lái),后通過(guò)環(huán)合試劑PyAOP/HOAt/NMM在溶液中完成環(huán)合；最后利用三氟乙酸脫去側(cè)鏈保護(hù)基獲得環(huán)肽粗品。經(jīng)反相高效液相色譜對(duì)所合成的環(huán)肽粗品進(jìn)行純化，首次成功完成對(duì)stylissamide Ⅰ的全合成，合成路線如圖2所示。

圖1 stylissamides I的結(jié)構(gòu)

圖2 stylissamides Ⅰ的合成路線

合成試劑與條件:a.Fmoc-Pro-OH,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,120 min; b.(Ⅰ) 20% 哌啶/N,N-二異丙基乙胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅱ) Fmoc-Tyr(OtBu)-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(Ⅲ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅳ) Fmoc-Tyr(OtBu)-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(Ⅴ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅵ) Fmoc-Tyr(OtBu)-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(Ⅶ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅷ) Fmoc-Pro-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(Ⅸ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅹ) Fmoc-Pro-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(Ⅺ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次;(Ⅻ) Fmoc-Val-OH,6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二異丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,30℃,40 min;(ⅩⅢ) 20% 哌啶/N,N-二甲基甲酰胺,30℃,10 min,重復(fù)2次; c.三氟乙醇/二氯甲烷(1∶4,V/V),30℃,4 h; d.六氟磷酸(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷,N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑,N-甲基嗎啡啉,N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,室溫,12 h; e.三氟乙酸/二氯甲烷(1∶3,V/V),室溫,2 h。

1 材料與方法

1.1 儀器

LOOYE ZX98-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、2ZX-4型旋片真空泵、低溫冷卻循環(huán)泵、SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)，CHA-S型氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，高效液相色譜系統(tǒng)及紫外檢測(cè)器(日本島津公司)，冷凍干燥機(jī)(美國(guó)LABCONCO公司)，6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(美國(guó)Agilent公司)，Bruker DRX 600 MHz型高分辨核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 主要試劑

Fmoc-氨基酸、二氯樹(shù)脂(吉爾生化上海有限公司); PyAOP,HCTU,HOAt,NMM(Adamas試劑公司); DIPEA(Acros試劑公司); TFE,TFA(百靈威科技有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇、哌啶(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 乙腈(J.T.Baker試劑公司)；雙蒸水(自制)。

1.3 方法

1.3.1樹(shù)脂的活化

將二氯樹(shù)脂1.0 g(載量0.3 mmol/g)加入到固相反應(yīng)器中，加入DCM與DMF各5 ml浸泡10 min后抽濾，使樹(shù)脂充分膨脹。

1.3.2Fmoc-氨基酸與樹(shù)脂的連接

將 Fmoc-Pro-OH(337.0 mg,1.0 mmol,3.3 倍當(dāng)量),DIPEA(387.6 mg,3.0 mmol,10.0倍當(dāng)量) 的DMF溶液加入到固相反應(yīng)器中，于氣浴恒溫振蕩器中30℃反應(yīng)120 min。反應(yīng)結(jié)束后，用DCM與DMF洗滌樹(shù)脂各5遍。

1.3.3Fmoc的脫除

每一步生成肽鍵反應(yīng)之前，均需脫除Fmoc保護(hù)。向固相反應(yīng)器中加入6 ml 20 %的哌啶/DMF溶液，于氣浴恒溫振蕩器中30℃反應(yīng)10 min，抽濾后再次加入6 ml 20 %的哌啶/DMF溶液反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用DCM與DMF洗滌樹(shù)脂各5遍。

1.3.4肽鍵的生成

所有后續(xù)Fmoc保護(hù)的氨基酸采用活化酯方法縮合。向連接在樹(shù)脂上脫去末端Fmoc保護(hù)的直鏈肽中加入Fmoc-氨基酸(1.0 mmol,3.3倍當(dāng)量),HCTU(413.7 mg,1.0 mmol,3倍當(dāng)量),DIPEA(387.6 mg,3.0 mmol,10.0倍當(dāng)量)的DMF溶液，于氣浴恒溫振蕩器中30℃反應(yīng)40 min，反應(yīng)完畢后，用DCM與DMF洗滌樹(shù)脂各5遍。重復(fù)此過(guò)程以及脫保護(hù)過(guò)程直至所有氨基酸全部接入。

1.3.5多肽的切割

向固相反應(yīng)器中加入TFE/DCM(1∶4,V/V) 混合溶液10 ml，于氣浴恒溫反應(yīng)器中30℃反應(yīng)4 h。抽濾收集濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，乙醚打漿后真空泵干燥，獲得直鏈肽粗品273.1 mg。

1.3.6直鏈肽的環(huán)合與凝膠柱純化

將直鏈肽粗品溶于DCM溶液(290.0 ml)，于0℃緩慢滴加至含有PyAOP(783.0 mg,1.5 mmol,5.0倍當(dāng)量),HOAt(204.2 mg,1.5 mmol,5倍當(dāng)量),NMM(303.5 mg,3.0 mmol,10倍當(dāng)量)的DMF溶液(10 ml)中。滴加完畢后于室溫反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑，得到淡黃色油狀液體。將其用甲醇溶解后，采用葡聚糖凝膠LH-20柱對(duì)其進(jìn)行初步純化，獲得帶側(cè)鏈保護(hù)基的環(huán)肽粗品243.4 mg。

1.3.7側(cè)鏈保護(hù)基的脫除和純化

將帶側(cè)鏈保護(hù)基的環(huán)肽粗品溶解于TFA/DCM(1∶3,V/V) 的混合溶液中，于室溫反應(yīng)2 h后旋干溶劑。采用反相高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行純化。色譜條件：SHIMADZU PRC-ODS柱(50 mm×250 mm,15 μm ) ；流動(dòng)相A:乙腈+0.1%TFA，流動(dòng)相B:水+0.1%TFA，線性洗脫梯度 B :100%～10%，洗脫時(shí)間30 min，流速6.0 ml/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。獲得純品176.7 mg，總收率67%。

2 結(jié)果與討論

2.1 stylissamide Ⅰ的HPLC表征

本研究以水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)stylissamide Ⅰ粗品進(jìn)行純化。粗品HPLC圖中峰數(shù)較多，主峰物質(zhì)含量為63.5%。通過(guò)制備色譜對(duì)主峰進(jìn)行純化，色譜圖中主峰明顯，含量為98.9%(圖3)。

圖3 stylissamide Ⅰ粗品與純品的HPLC圖譜

2.2 stylissamide Ⅰ的高分辨質(zhì)譜表征

通過(guò)Q-TOF LC/MS分析，質(zhì)譜圖中880.426 4對(duì)應(yīng)[M+H]+峰,902.402 4對(duì)應(yīng)[M+Na]+峰(圖4)，與stylissamide Ⅰ理論分子量879.416 7相比，誤差值為1.1×10-5，顯示主峰物質(zhì)分子量與stylissamide Ⅰ相符。隨后，采用MassHunter Workstation(Agilent Tech)質(zhì)譜工作站對(duì)分子式進(jìn)行匹配，分子式為C47H57N7O10,與理論分子式相符。

圖4 stylissamide Ⅰ純化后的高分辨質(zhì)譜圖

2.3 stylissamide Ⅰ的核磁共振氫譜與碳譜表征

本研究通過(guò)600 MHz核磁共振氫譜與碳譜對(duì)所合成環(huán)肽進(jìn)行進(jìn)一步表征。

1H-NMR(600 MHz,d-DMSO):δ 9.01(d,J=6.0 Hz,1H),8.61(d,J= 6.0 Hz,1H),8.28(d,J=6.0 Hz,1H),7.92(s,3H),7.81(d,J=6.0 Hz,1H),7.07-7.00(m,6H),6.71-6.62(m,6H),4.22-4.20(m,1H),3.89(s,1H),3.56-3.36(m,11H),3.01-2.98(m,1H),2.89-2.84(m,2H),2.73-2.65(m,3H),2.17-2.07(m,2H),1.99-1.80(m,11H),0.92-0.78(m,6H)。

13C-NMR(600 MHz,d-DMSO):δ 173.7,171.7,170.6,170.5,170.1,169.3,168.4,158.5,158.3,157.0,156.4,156.2,131.1,131.0,130.6,130.6,130.5,128.0,127.7,125.1,118.5,116.5,115.8,115.6,115.4,115.3,59.5,58.9,57.9,55.7,54.8,53.9,52.6,47.1,37.3,36.7,36.5,30.7,29.1,29.0,28.5,25.0,24.9,24.9,19.5,18.4,18.2。

2.4 環(huán)合反應(yīng)的策略

2.4.1環(huán)合方式的選擇

目前公認(rèn)的多肽環(huán)合策略可分為液相環(huán)合與固相環(huán)合兩種。液相環(huán)合策略在氨基酸連接完畢后，在弱酸的條件下將帶有保護(hù)基的多肽切下，在溶液中進(jìn)行環(huán)合后利用強(qiáng)酸切除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，需要進(jìn)行反復(fù)的純化并且可能產(chǎn)生二聚體或多聚體等副產(chǎn)物，使得其合成效率和合成總收率都較低。固相環(huán)合策略則是在樹(shù)脂上完成直鏈多肽連接后，直接利用環(huán)合試劑在固相載體上進(jìn)行環(huán)合，經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸切割后直接得到目標(biāo)產(chǎn)物，無(wú)需反復(fù)的純化步驟，同時(shí)樹(shù)脂的假稀釋作用避免了二聚體與多聚體的生成，是目前公認(rèn)的優(yōu)于液相環(huán)合的一種環(huán)合策略[23]。然而，固相環(huán)合條件較為苛刻，需要氨基酸殘基側(cè)鏈提供額外的羧基用于偶聯(lián)樹(shù)脂(如天冬氨酸或谷氨酸)。本研究中的stylissamide Ⅰ并不符合固相環(huán)合的條件，因此，課題組選擇液相環(huán)合策略對(duì)其進(jìn)行全合成。

2.4.2環(huán)合位點(diǎn)的選擇

在環(huán)肽的合成中，環(huán)合位點(diǎn)的確定決定著合成的成敗。環(huán)合位點(diǎn)選擇不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致關(guān)環(huán)速率減慢，產(chǎn)生二聚化、低聚化以及差向異構(gòu)化等副產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)，環(huán)合位點(diǎn)的確定應(yīng)遵循4個(gè)原則[24]：①在通常情況下，應(yīng)避免在N-烷基、α,α-二取代、β-取代等空間位阻大的氨基酸，如纈氨酸和異亮氨酸之間環(huán)合。然而，脯氨酸是一個(gè)特例，選擇脯氨酸為關(guān)環(huán)位點(diǎn)也可以獲得較好的環(huán)合效果。②應(yīng)盡量選擇在L構(gòu)型和D構(gòu)型的氨基酸之間環(huán)合，不同構(gòu)型的氨基酸之間發(fā)生的環(huán)合反應(yīng)速率比相同構(gòu)型氨基酸之間更快。③可借助X-晶體衍射或分子模型來(lái)確定能促進(jìn)環(huán)合反應(yīng)的分子內(nèi)氫鍵的位置，并選擇此處為環(huán)合位點(diǎn)。④能引起分子骨架扭轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)有利于環(huán)合，例如甘氨酸。綜上所述，考慮到環(huán)合未知空間位阻對(duì)環(huán)合速率及產(chǎn)率的影響，本研究選擇在脯氨酸之間進(jìn)行環(huán)合。

2.4.3環(huán)合條件的確定

較為常用的環(huán)合試劑主要有HOAt、HOBt、PyAOP、PyBOP等。本研究選擇PyAOP/HOAt為環(huán)合試劑對(duì)，選用NMM提供堿性環(huán)境，室溫反應(yīng)12 h，成功完成環(huán)合反應(yīng)[25]。

液相環(huán)合策略的一個(gè)主要問(wèn)題是環(huán)合過(guò)程容易形成分子間的二聚體和多聚體副產(chǎn)物，影響合成產(chǎn)率。我們通過(guò)高度稀釋的方法，將直鏈肽溶液濃度控制在約1 mg/ml，并在低溫條件下向環(huán)合試劑溶液中緩慢滴加，明顯減少了線性或環(huán)狀二聚體和多聚體的產(chǎn)生[26]。

3 結(jié)論

本研究使用二氯樹(shù)脂為載體固相合成了直鏈七肽，而后將其從樹(shù)脂上切下，利用環(huán)合試劑在溶液中完成環(huán)合，最后在酸性條件下脫除全部側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，成功獲得環(huán)肽粗品。經(jīng)反相高效液相色譜純化得到目標(biāo)環(huán)肽stylissamide Ⅰ，產(chǎn)物純度達(dá)到98.9%，合成總收率為67%。通過(guò)高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜與碳譜分析，確定合成產(chǎn)物為目標(biāo)環(huán)肽stylissamide Ⅰ。本研究首次完成了環(huán)肽stylissamide Ⅰ的化學(xué)全合成，合成方法具有快捷、簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)，為該環(huán)肽及其他類似環(huán)肽類化合物的固相全合成提供了參考。