陶朝陽，邢心睿，陳 思，曹 奇，丁德英，朱臻宇

(1.西藏軍區(qū)總醫(yī)院藥物制劑研究中心，西藏 拉薩 8500071；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

扶正化瘀膠囊(舊名肝平膠囊、扶正化瘀方、319方)是由上海中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)過20余年研究，采用現(xiàn)代技術(shù)自主研發(fā)生產(chǎn)的復(fù)方中成藥，該方由丹參、桃仁、五味子、冬蟲夏草、絞股藍、松花粉六味藥材組成，丹參在方中活血祛瘀作為君藥；冬蟲夏草補虛損、益精氣，桃仁助丹參活血祛瘀，共為臣藥；松花粉益氣潤燥，絞股藍清熱解毒，共為佐藥；五味子味酸，為引經(jīng)使藥[3-4,10,16]。該藥針對肝纖維化血瘀研制，臨床治療效果顯著，是國家“八五”科技攻關(guān)成果，受國家發(fā)明專利保護，已獲得國家中藥Ⅲ類新藥證書。扶正化瘀片于2006年通過美國食品和藥品監(jiān)督管理局審批，免于Ⅰ期臨床，直接進入Ⅱ期臨床實驗；2013年該復(fù)方圓滿完成Ⅱ期臨床實驗，使扶正化瘀片成為肝病領(lǐng)域第一個通過美國Ⅱ期臨床試驗的中成藥，也有望成為首個獲準(zhǔn)進入美國主流醫(yī)藥市場的復(fù)方中藥。

該復(fù)方在我國已使用多年，但由于其組分復(fù)雜，一直缺乏系統(tǒng)性研究，盡管目前關(guān)于該復(fù)方作用機制的報道較多[1-2,5-8]，但是整個復(fù)方的化學(xué)成分還未見報道。因此，明確扶正化瘀膠囊各個組分的化學(xué)成分對于深入研究該復(fù)方治療效果、闡明各個組分發(fā)揮作用的機制療效具有重要意義。

UHPLC和Q-TOF/MS的串聯(lián)技術(shù)在中藥復(fù)方等復(fù)雜體系研究中占有一定優(yōu)勢，該技術(shù)集色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏、高分辨、強定性能力于一體，已經(jīng)成為中藥復(fù)方化學(xué)成分分析和鑒定的有效手段之一[12-14]。本實驗采用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)首次對扶正化瘀膠囊中的化學(xué)成分進行快速分析，并對各個成分進行藥材歸屬，進一步闡明了扶正化瘀膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity 液相系統(tǒng)，包括G4220A四元泵、G4226自動進樣器G1316C柱溫箱(安捷倫科技有限公司，美國)；Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)及MassHunter Qualitative Analysis Software 分析工作站(安捷倫科技有限公司，江蘇南京)；JY10001十萬分之一電子天平(精密科學(xué)儀器有限公司，上海)；Heal Force SMART-N 超純水機(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，香港)；Micro 17高速離心機(Thermo Fisher Scientific，美國)；甲醇、乙腈均為色譜純(Merck，德國)，甲酸為色譜級(ROE scientific INC，美國)，水為實驗室制備的超純水，其他試劑均為分析級。

1.2 藥品與試劑

丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、丹酚酸A、丹參酮ⅡA、苦杏仁苷、腺苷、蟲草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚對照品(一飛生物科技有限公司，上海，純度≥98%)。扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責(zé)任公司)購自益豐大藥房，批號：161220、170640、171116。

1.3 對照品溶液制備

分別用毛細管蘸取約0.1 mg的丹酚酸B、二氫丹參酮I、丹酚酸A、丹參酮ⅡA、苦杏仁苷、蟲草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚對照品置于200 μl的甲醇溶液中制成對照品混合溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于25 ml棕色具塞量瓶中，加入25 ml甲醇適量溶解，超聲(功率：300 W，頻率：40 kHz)處理60 min，補足減失的甲醇，室溫放置20 min，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液于離心管中，于16 000 r/min離心10 min，取上清液，即得扶正化瘀膠囊樣品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters Corporation，Ireland)。流動相采用0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)。梯度洗脫條件：0～3 min，2%B；3～18 min，2%～50%B；18～22 min，50%～95% B；22～25 min，95%B。平衡時間為10 min，流速為0.4 ml/min，分析所用時間為25 min。進樣體積設(shè)置為3 μl，柱溫箱溫度為40 ℃，自動進樣器的溫度為4 ℃。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源采用正/負離子模式。正離子模式條件：毛細管電壓4 V；干燥氣體流速11 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；霧化器壓力45 psig；碎片電壓120 V；Skimmer電壓60 V。質(zhì)譜采集范圍100～1 100m/z，參比離子m/z為121.0509。

1.7 扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

根據(jù)國內(nèi)外已有的專業(yè)數(shù)據(jù)庫TCM@taiwan、TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)和上海中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)研究文獻，共收集了扶正化瘀膠囊六味藥材中801個化學(xué)成分。利用Agilent公司研發(fā)的Formula-Database-Generator軟件，通過各化學(xué)成分包含碳、氫、氧的個數(shù)，計算化合物精確的相對分子質(zhì)量，建立化學(xué)成分的分子式和相對分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件優(yōu)化

對于樣品提取溶劑，本實驗首先采用了乙腈和甲醇2種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取樣品的峰容量明顯高于乙腈，而且部分的主峰響應(yīng)也更佳，故放棄了使用乙腈溶劑的提取方法。

關(guān)于色譜條件考察，本實驗比較了甲醇-水和乙腈-水，實驗結(jié)果顯示乙腈-水的洗脫系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水，而且各峰之間的分離效果更好。加入0.1%的甲酸可以提高峰響應(yīng)，還可以改善峰拖尾，因此采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液的洗脫系統(tǒng)。

2.2 扶正化瘀膠囊總離子流圖

精密吸取扶正化瘀膠囊供試品溶液和對照品混合溶液200 μl置進樣小瓶，按照上述色譜和質(zhì)譜的測試條件進行樣品分析，得到扶正化瘀方樣品溶液正、負離子模式下的總離子流圖，如圖1所示。

圖1 扶正化瘀膠囊供試品TOF/MS總離子流圖 A.正離子模式；B.負離子模式1.丹酚酸B；2.二氫丹參酮I；3.丹酚酸A；4.丹參酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.蟲草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

2.3 利用對照品鑒別扶正化瘀膠囊中的化合物

實驗中利用已有的對照品，無差別鑒別出丹酚酸B(峰1)、二氫丹參酮Ⅰ(峰2)、丹酚酸A(峰3)、丹參酮ⅡA(峰4)、苦杏仁苷(峰5)、蟲草素(峰6)、五味子醇甲(峰7)、五味子乙素(峰8)、五味子酯甲(峰9)、山柰酚(峰10)，對照品混合溶液正離子模式下的總離子流圖如圖2A，丹參酮ⅡA、二氫丹參酮Ⅰ在扶正化瘀膠囊供試品和對照品混合溶液正離子模式下提取離子流圖，如圖2B、圖2D和圖2C、圖2E。

2.4 化合物鑒別的方法

以正離子模式下4號峰丹參酮ⅡA為例介紹扶正化瘀膠囊中色譜峰的鑒別過程。TIC圖中的保留時間為8.751 min(圖2B)的色譜峰顯示的準(zhǔn)分子離子為295.136 2，利用 Qualiative Analysis 軟件分析工具計算精確質(zhì)量數(shù)的可能的元素組成(<5 ppm)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已知化合物的質(zhì)荷比，初步確定分子式為 C19H18O3。通過計算該準(zhǔn)分子離子的核素分布情況，從圖3A可以看出同位素分布的理論值與實際值恰好吻合，確定此峰為丹參酮ⅡA。同理可得該模式下2號峰二氫丹參酮Ⅰ的解析過程，如圖3B。

2.5 扶正化瘀膠囊中化學(xué)成分的鑒別結(jié)果

根據(jù)飛行時間質(zhì)譜測得的精確的相對分子質(zhì)量，比對所建的扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，應(yīng)用 Qualiative Analysis質(zhì)譜分析軟件計算分子組成，將理論值與實測值進行比對，結(jié)合上述對照品鑒別結(jié)果及相關(guān)文獻報道[9,11,15]，對扶正化瘀膠囊在正/負離子模式下所得色譜圖中色譜峰分析，在正離子模式下初步鑒別 出 115個化學(xué)成分，結(jié)果見表1。在負離子模式下初步鑒別出66個化學(xué)成分，結(jié)果見表2。其中，正、負離子模式下均有響應(yīng)的有 28個(表中標(biāo)#)。對于部分為未區(qū)分的同分異構(gòu)體，后期可考慮調(diào)節(jié)碎片電壓得到化合物的裂解規(guī)律進而區(qū)分。對于化學(xué)成分的藥材歸屬，由表1和表2可見，對于峰容量較大和響應(yīng)強度較高的化學(xué)成分主要集中于君藥丹參，臣藥冬蟲夏草和桃仁，符合中藥復(fù)方配伍原則。

圖2 扶正化瘀膠囊供試品、對照品溶液的總離子流圖和提取離子流圖 A.對照品混合溶液正離子模式下總離子流圖；B.扶正化瘀膠囊供試品溶液對丹參酮ⅡA提取離子流圖；C.對照品混合溶液對丹參酮ⅡA提取離子流圖；D.扶正化瘀膠囊供試品溶液對二氫丹參酮Ⅰ提取離子流圖；E.對照品混合溶液對二氫丹參酮Ⅰ提取離子流圖1.丹酚酸B；2.二氫丹參酮Ⅰ；3.丹酚酸A；4.丹參酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.蟲草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

圖3 正離子模式下化合物準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量及同位素分布圖 A.丹參酮ⅡA；B.二氫丹參酮Ⅰ

編號保留時間(t/min)化合物名稱化學(xué)式M+X理論分子量(m/z)實際分子量(m/z)誤差(/10-6)歸屬藥材C11.118ferulicacidC10H10O4(M+H)+195.0665195.0658-1SalviamiltiorrhizaBge.C21.693ziganeinC15H10O4(M+H)+255.0667255.0650.42SalviamiltiorrhizaBge.C36.615dihydrokaranoneC15H22O(M+H)+219.174219.17420.28SalviamiltiorrhizaBge.C43.229dihydronortanshinoneC17H14O4(M+H)+283.0968283.0972-2.31SalviamiltiorrhizaBge.C56.713danshenspiroketallactoneC17H16O3(M+H)+269.1172269.1173-1.74SalviamiltiorrhizaBge.C67.264isotanshinoneIC18H12O3(M+H)+277.0861277.0866-2.26SalviamiltiorrhizaBge.C73.139monodydroxytanshinoneIC18H12O4(M+H)+293.0811293.08051.3SalviamiltiorrhizaBge.C81.266salvianolicacidG#C18H12O7(M+H)+341.0657341.06530.05SalviamiltiorrhizaBge.C97.847dihydrodanshinoneI?C18H14O3(M+H)+279.102279.1018-0.04SalviamiltiorrhizaBge.C105.5223-hydroxymethylenetanshin-quinoneC18H14O4(M+H)+295.0969295.0962-1.31SalviamiltiorrhizaBge.C117.617miltironeIC18H16O2(M+H)+265.1223265.12171.78SalviamiltiorrhizaBge.C126.1381,2,15,16-tetrahydrotanshi-noneIC18H16O3(M+H)+281.1172281.11670.99SalviamiltiorrhizaBge.C134.84(+-)-danshexinkunAC18H16O4(M+H)+297.1124297.1122-1.94SalviamiltiorrhizaBge.C142.35kaempferol?#C18H16O5(M+H)+313.1083313.10681.36SalviamiltiorrhizaBge.C155.3174-methylenemiltironeC18H18O2(M+H)+267.1383267.1382-0.16SalviamiltiorrhizaBge.C161.2ttanshindiolBC18H18O5(M+H)+315.1206315.1221-0.53SalviamiltiorrhizaBge.C179.138salvinoneC18H20O2(M+H)+269.1539269.1537-2.67SalviamiltiorrhizaBge.

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

注：*已通過對照品鑒別；#均經(jīng)正、負離子模式下鑒別

表2 扶正化瘀膠囊中化學(xué)成分的負離子模式鑒別

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

注：*已通過對照品鑒別；#均經(jīng)正、負離子模式下鑒別

3 結(jié)論

本研究首次運用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)快速初步鑒別出扶正化瘀膠囊154個化學(xué)成分，利用已有的標(biāo)準(zhǔn)品已成功鑒別10個成分，表征了扶正化瘀膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其進一步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及體內(nèi)外藥理研究提供了前提條件，為扶正化瘀膠囊的深入研究奠定良好基礎(chǔ)。