何曉波，朱佳慧，高方圓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)：a.學(xué)員十六隊，b.學(xué)員一隊，c.海軍醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海 200433)

生物技術(shù)藥物(biotechnology drugs)是利用DNA重組技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或其他創(chuàng)新生物技術(shù)，以生物體作為原料而生產(chǎn)的用于預(yù)防、診斷及治療的藥物[1]。生物技術(shù)藥物產(chǎn)生于活細胞且具有優(yōu)良的靶向性、高特異性、生物活性以及免疫原性，其最大的特點是能對疾病的致病機制發(fā)揮藥效，而不易引起與傳統(tǒng)小分子藥物相關(guān)的副作用，對使用傳統(tǒng)藥物治療效果不佳的患者，可有效改善治療效果，被譽為21世紀以來最具希望和發(fā)展?jié)摿Φ男屡d高科技藥物[2]。但生物技術(shù)藥物與傳統(tǒng)的小分子藥物在理化性質(zhì)、生物性質(zhì)上極為不同，其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程也存在很大的差別。

生物技術(shù)藥物藥動學(xué)研究與傳統(tǒng)小分子藥物之藥動學(xué)研究理念相同，即運用數(shù)學(xué)模型和動力學(xué)原理，定量或定性描述生物技術(shù)藥物通過各種給藥方式進入機體后，在吸收、分布、代謝、排泄 (absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)過程中發(fā)生的變化和動態(tài)規(guī)律，如利用insilico和invitro[3]等模型探究藥物分子在體內(nèi)發(fā)生作用時的代謝特征和分子性質(zhì)。然而，生物技術(shù)藥物分類廣泛，每一類都有其各自的特點和作用機制，使得各類藥物的藥動學(xué)特征表現(xiàn)出極大的不同。深入而透徹地研究生物技術(shù)藥物藥動學(xué)特征，是整個藥物研發(fā)過程不可缺少的部分，同時也為后續(xù)的藥理學(xué)研究、毒理學(xué)評價、藥物制劑研究和臨床評價等提供重要的科學(xué)參考價值[3]。

1 生物技術(shù)藥物的分類

生物技術(shù)藥物包括治療性蛋白質(zhì)、多肽、抗生素、抗原、基因和細胞治療藥物等，目前已上市的生物技術(shù)藥物主要用于治療癌癥、人類免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、遺傳疾病等。本文將生物技術(shù)藥物分為兩類：第1類是重組蛋白類或重組多肽類藥物，包括單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)藥物、細胞因子(cytokines)藥物、激素(hormones)藥物等[5]。第2類是重組DNA藥物，包括反義寡核苷酸藥物(antisense oligonucleotides,ASON)、DNA疫苗等。

2 分析方法

2.1 重組蛋白、多肽類藥物

蛋白多肽類藥物作為現(xiàn)代主流的生物技術(shù)藥物，其藥動學(xué)研究相較于小分子藥物存在一定的困難，主要歸于兩方面原因：一是單次給藥量小、血藥濃度低，二是容易受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。因此，對此類藥物的研究需采用靈敏度更高、專屬性更強的實驗分析方法。目前常用的分析方法主要有以下4大類。

2.1.1同位素標記示蹤法

同位素標記示蹤法包括放射性同位素示蹤法和穩(wěn)定性同位素示蹤法，前者通過3H、18F、125I、14C等放射性核素作為示蹤劑替換相應(yīng)的普通元素(兩者具有相同的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì))對藥物分子進行標記，而后利用放射性檢測儀器檢測特征性射線來追蹤標記藥物的位置、數(shù)量和代謝過程[6]。林立紅等[7]利用14C標記2-氟-6-三氟甲基吡啶(JJBD)，通過放射性檢測儀器液體閃爍計數(shù)儀(LSC)測定JJBD在大鼠血漿、組織、糞便等樣品中的放射物含量，對應(yīng)計算藥物的濃度。穩(wěn)定同位素示蹤法原理上是以同位素替換對應(yīng)元素產(chǎn)生的質(zhì)量差作為特征，用質(zhì)量測定儀器進行分析的技術(shù)。

同位素示蹤法解決了蛋白多肽類藥物在體內(nèi)代謝途徑復(fù)雜、含量限度低導(dǎo)致難以檢測等問題，具有操作簡潔、靈敏度高且具有對藥物性質(zhì)和機體影響小的優(yōu)點，但其具有的放射性污染仍是該技術(shù)難以避免的一大缺點。

2.1.2活體成像法

活體成像技術(shù)是一種運用多種成像方法，在活體中直接觀察藥物分子在組織、細胞層面分布變化的技術(shù)。目前主要包括核素成像技術(shù)與熒光標記成像技術(shù)兩大類。

核素成像技術(shù)在臨床上應(yīng)用廣泛，是活體成像技術(shù)的經(jīng)典方法之一，利用放射性核素的放射特征，應(yīng)用檢測儀器對放射性核素標記的生物分子進行成像分析。熒光標記成像技術(shù)聯(lián)合了熒光標記與活體成像技術(shù)，具有靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)等行業(yè)。趙小亮等[8]用活化的熒光染料(Cy7)標記海茸 β-1,3/1,6-葡聚糖(DAG)獲得熒光標記的Cy7-DAG，利用小動物成像系統(tǒng)對尾靜脈注射該藥物的小鼠進行熒光信號成像處理，可直觀分析其在小鼠體內(nèi)組織和器官的分布情況，為后續(xù)藥動學(xué)、毒理學(xué)等研究提供了重要參考。

活體成像技術(shù)將體內(nèi)藥物分布可視化，為藥物的藥動學(xué)研究提供了強有力的手段。其非侵入性的分析特征可對同一實驗體進行連續(xù)數(shù)據(jù)分析，避免了不同個體可能帶來的數(shù)據(jù)差異性。

2.1.3免疫分析法

生物技術(shù)藥物本身的免疫原性，使得免疫分析法也成為其藥動學(xué)研究的分析手段之一。傳統(tǒng)的免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA) 、放射免疫分析(RIA)、熒光免疫分析(FIA)等，新型的免疫分析技術(shù)還包括生物傳感器免疫分析(biosensor immunoassay，BIA)、毛細管電泳免疫分析(capillary electrophoresis-based immunoassay，CEIA)、測流免疫分析等。

傳統(tǒng)免疫分析法雖然經(jīng)典但反應(yīng)速度慢，易受外界因素影響。近年來具有更高靈敏度、更高效率、較低成本的新型免疫分析法逐漸誕生。毛細管電泳免疫分析技術(shù)結(jié)合了毛細管電泳的分離能力和免疫分析的配體特異性，具有檢測時間短、易于檢測復(fù)雜生物化合物的優(yōu)點，目前已被廣泛用于蛋白質(zhì)、激素等生物技術(shù)藥物的藥動學(xué)研究[9-10]。

2.1.4色譜法

目前常用于蛋白質(zhì)和多肽藥物藥動學(xué)分析的色譜技術(shù)有HPLC法和高效毛細管電泳(HPCE)法。HPLC法是基于液相色譜和氣相色譜發(fā)展起來的新型色譜技術(shù)，具有檢測靈敏度高、分離效率高、速度快等優(yōu)點。HPCE法采用高壓電場作為驅(qū)動力，在微米級內(nèi)徑的毛細管中分離生物技術(shù)藥物，故比起前者分析速度更快、柱效更高，且樣品消耗量低，但分離容量小是其一大缺點。

色譜法常與質(zhì)譜等其他技術(shù)聯(lián)合使用，既能達到高效分離的目的，也可獲取蛋白結(jié)構(gòu)信息，以便于定性鑒別。Wang等[11]通過尾靜脈注射、口服灌胃、腹腔注射3種給藥方式對雌性ICR小鼠給予輪枝菌素A，并在給藥后不同時間點通過心臟穿刺獲取血液樣本，利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定量分析血漿樣本中的輪枝菌素A，探究了不同給藥方式對輪枝菌素A在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響，并發(fā)現(xiàn)口服和靜脈注射給藥引起輪枝菌素A在小鼠體內(nèi)相對較高的暴露量。

2.2 重組基因藥物

重組基因藥物的藥動學(xué)分析技術(shù)與蛋白多肽類藥物部分重疊，可使用色譜法、免疫分析法、同位素標記示蹤法、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法等技術(shù)。目前基于色譜法已發(fā)展出許多高靈敏檢測技術(shù)，例如離子對反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ion-pair reversed-phase LC-MS/MS)[12]，利用離子對系統(tǒng)改善了LC / MS性能，彌補了傳統(tǒng)反相色譜對寡核苷酸保留時間不足的缺點。此外，Dong等[13]通過基質(zhì)場放大和柱頭場放大堆疊注射的結(jié)合，在不降低分辨率的情況下成功開發(fā)出靈敏度高于電動注射近3 000倍的毛細管凝膠電泳聯(lián)用紫外檢測法(capillary gel electrophoresis with ultraviolet detection，CGE-UV)。色譜法雖然具有重復(fù)性好、分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，但由于基因藥物藥動學(xué)研究的特殊性和復(fù)雜性，其他先進的分析技術(shù)也必不可少。

由于液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對于部分基因藥物靈敏度不高，其可以檢測到的血漿定量下限(LLOQ)過高，范圍可達50～150 ng/ml[14]，難以對基因藥物給藥24 h后的“分布后階段”血藥濃度進行定量分析，所以需要更靈敏的生物分析方法進行監(jiān)測。例如Burki等[15]研發(fā)的超靈敏雜交ELISA法，對多肽磷酸二酰氨基酚嗎啉寡核苷酸的檢測下限能達到5 pmol/L，比普通液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)更靈敏，可根據(jù)分布后階段血藥濃度與組織分布存在的平衡關(guān)系，分析組織內(nèi)藥物的累積和清除情況。

3 生物技術(shù)藥物的藥動學(xué)特點

3.1 吸收

生物技術(shù)藥物胃腸道穩(wěn)定性有限、分子量較大、親脂性差，致其既難以在胃腸道中穩(wěn)定存在，又不易滲透過親脂性的腸壁，因此主要通過靜脈注射、皮下注射、肌內(nèi)注射3種侵入性方式給藥。目前對于非侵入性的給藥方式也在進一步的研究和改進，以降低藥物的施用難度，提高患者的依從性并改善藥物的治療潛力。非侵入性給藥途徑主要包括口服、吸入或經(jīng)鼻腔黏膜、口腔黏膜和透皮給藥[16-17]。Ueno[18]等研制出的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)鼻腔給藥技術(shù)，能從人體鼻黏膜下層迅速吸收入血，既提高了患者的依從性，又降低了藥物的不良反應(yīng)。

由于受藥物溶解度和注射體積的限制，皮下注射和肌內(nèi)注射僅適用于藥物效力相對較高的生物技術(shù)藥物，其余藥物仍需靜脈注射給藥。生物技術(shù)藥物的體內(nèi)吸收主要通過淋巴管的對流運輸和跨血管擴散兩種途徑。毛細淋巴管相比毛細血管缺乏基底膜而富含內(nèi)皮細胞間的空隙，故其對大分子藥物的滲透性更強。如皮下注射給藥，當(dāng)藥物相對分子質(zhì)量(分子量)較小時，主要通過擴散進入毛細血管；當(dāng)分子量較大時，主要以淋巴系統(tǒng)吸收為主[19]。

3.2 分布

生物技術(shù)藥物受自身理化特性、與組織的結(jié)合能力、不同的給藥途徑以及較高的組織滲透性等因素影響，與小分子藥物相比，從分布血液到外周組織均緩慢而有限。有文章報道，靜脈注射生物技術(shù)藥物后，表觀分布容積接近血漿容量，表明其向外周組織分布有限[20]。生物技術(shù)藥物體內(nèi)分布的主要方式是細胞的胞吞作用以及毛細管壁空隙的對流運輸。對流運輸?shù)闹饕绊懸蛩厥敲氀鼙趦蓚?cè)的靜態(tài)壓和毛細血管壁的孔徑尺寸。胞吞作用主要涉及受體介導(dǎo)的胞吞作用和液相胞飲，前者通過藥物分子與細胞表面特異性受體結(jié)合引起內(nèi)吞，由于受體數(shù)量有限而具有飽和性；后者是受細胞外濃度驅(qū)動的非特異性過程，例如mAb進入內(nèi)皮細胞的主要途徑為液相胞飲[21]。

此外，生物技術(shù)藥物與靶點的親和性以及體內(nèi)的屏障系統(tǒng)也會影響其在體內(nèi)的分布。例如，根據(jù)生物技術(shù)藥物與目標靶點的親和性，預(yù)測其表觀分布容積以及體內(nèi)分布情況。Hansen等[22]對實驗兔靜脈注射人源化單克隆抗體康昔單抗，通過免疫組化分析顯示其主要定位在肝、皮膚、主動脈等器官的微血管內(nèi)皮上。血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的存在會限制生物技術(shù)藥物在腦和腦脊液中的分布。親水性的大分子生物技術(shù)藥物(如mAb)難以通過血-腦屏障，其在腦脊液中的水平僅達血清水平的0.1%～1%[23-24]。

3.3 代謝與排泄

影響生物技術(shù)藥物代謝的主要因素包括結(jié)構(gòu)特征、分子大小、電荷密度與分布、親脂性與親水性差異等。與傳統(tǒng)小分子藥物不同，生物技術(shù)藥物一般不通過細胞色素酶進行代謝，而與內(nèi)源性蛋白質(zhì)的分解代謝途徑相同，可被蛋白酶水解為多肽或氨基酸，以能源物質(zhì)或蛋白質(zhì)合成原料的形式被代謝消除[25-26]。生物技術(shù)藥物在體內(nèi)有兩條代謝途徑，一是通過Fab區(qū)域與藥物靶點之間相互作用介導(dǎo)的特異性清除途徑，二是通過Fc區(qū)和Fc受體之間相互作用介導(dǎo)的非特異性清除途徑[27-28]。此外，Robbie等[29]表明人源化單克隆抗體莫他維珠單抗-YTE突變體在體內(nèi)能通過與新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合來減緩非特異性途徑的清除。

生物技術(shù)藥物的體內(nèi)代謝部位主要有肝臟、腎臟、血液和血管外組織等。在肝臟中，肝細胞通過轉(zhuǎn)運過程中受體介導(dǎo)的吞飲作用參與藥物的分解代謝。腎臟的分解代謝主要針對低分子量的生物技術(shù)藥物(分子量<30 000)，如小分子蛋白和多肽，經(jīng)腎小球過濾，然后經(jīng)腎近端小管被上皮細胞以受體介導(dǎo)方式攝取，分解為氨基酸原料再次進入體循環(huán)，尿液中的原形藥物含量可忽略不計[30]。生物技術(shù)藥物可通過膽汁排泄，例如胰島素和表皮生長因子在肝臟中被代謝分解，隨后產(chǎn)物排入膽汁，以糞便形式排出體外[20]。

4 生物技術(shù)藥物與小分子藥物藥動學(xué)比較

為深入探討生物技術(shù)藥物的藥動學(xué)特征，以近年來備受關(guān)注的mAb作為研究對象?？偨Y(jié)2017—2018年美國批準的9種mAb藥物的藥動學(xué)數(shù)據(jù)[31-32]，見表1。

表1 2017-2018年美國批準的單克隆抗體藥物的藥動學(xué)特征

注：“/”表示FDA公布的處方信息中未涉及

mAb藥物的藥動學(xué)特征與傳統(tǒng)小分子藥物相比呈現(xiàn)極大的不同：①呈非線性藥動學(xué)(PK)。mAb藥物在體內(nèi)主要與靶標蛋白或靶標細胞特異性結(jié)合，不與血漿蛋白發(fā)生結(jié)合，當(dāng)目標靶點為可溶性抗原且內(nèi)源水平較低時，表現(xiàn)出非線性PK的趨勢；傳統(tǒng)小分子藥物在體內(nèi)的結(jié)合往往是非特異性的，能影響多種酶的作用，一般呈線性PK，其與血漿蛋白的結(jié)合是影響PK的重要因素。②半衰期較長。mAb的代謝方式需依賴于與內(nèi)源性蛋白相同的非特異性代謝途徑或與受體結(jié)合的特異性代謝途徑，半衰期較長；傳統(tǒng)小分子的代謝途徑一般通過例如細胞色素P450等酶的作用進行，半衰期短于mAb[33-36]。③表觀分布容積較小。mAb在體內(nèi)的分布通常局限于血管和細胞間質(zhì)中，傳統(tǒng)小分子藥物分布可深入組織，擁有更大的表觀分布容積。

5 展望

隨著生物技術(shù)藥物的不斷興起，人們逐漸加深了對其藥動學(xué)的認知。生物技術(shù)藥物藥動學(xué)特征相比于傳統(tǒng)小分子藥物更為復(fù)雜，研究更具難度。但隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、藥物分析學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，更加靈敏、高效的新一代生物分析方法必將研制出來，以進一步研究生物技術(shù)藥物的藥動學(xué)特點和機制，為優(yōu)化生物技術(shù)藥物的研發(fā)方案以及指導(dǎo)臨床用藥提供強有力的后盾[35]。