原曉龍，李云琴，王 毅

(云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

滇牡丹(Paeoniadelavayi)屬芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)落葉小灌木，是中國(guó)西南地區(qū)特有的牡丹種[1]。黃色花滇牡丹在牡丹花色改良過(guò)程中是一種珍稀的育種資源[2]。目前，已從滇牡丹黃色花瓣中分離得到查爾酮、黃酮和黃酮醇等黃酮類色素[3]，其中，查爾酮是使花朵呈現(xiàn)黃色的主要黃酮類物質(zhì)之一[4-5]。利用植物基因工程技術(shù)在花卉原有性狀不喪失的前提下對(duì)其花色性狀進(jìn)行定向修飾，可獲得特定色彩的花卉[6-7]。從滇牡丹中分離其特有的黃色花系基因，可為培育具黃色性狀的牡丹觀賞新品種提供重要的基因資源。

查爾酮合成酶(chalcone synthase， CHS， EC2.3.1.47)屬于植物Ⅲ型聚酮合酶家族的一員，該酶家族包括芪合成酶(stilbene synthase， STS)、吖啶酮合成酶(acridone synthase)、吡喃酮合成酶(pyrone synthase)等[8-9]。CHS是類黃酮類化合物生物合成過(guò)程的關(guān)鍵酶和限速酶[10]，催化1分子的p-香豆酰CoA或p-二氫香豆酰CoA與3個(gè)源于丙二酰CoA的二碳單位形成黃色柚皮素查爾酮(naringenin chalcone)、根皮素(phloretin)或芪類化合物，這些化合物是類黃酮生物合成過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，為其提供了基本的碳骨架[9，11]。CHS在植物中的表達(dá)量及其存在與否可影響植物中類黃酮類物質(zhì)的含量，可能改變花色的深淺程度[6]。已從多種植物中分離出CHS基因，如松葉蕨(Psilotumnudum)[12]、蘋果屬(Malus)[13]植物等。研究表明，CHS在調(diào)控合成速率方面扮演重要角色[8]，CHS基因表達(dá)受紫外線、機(jī)械創(chuàng)傷或病原體侵害影響[9]。為了解滇牡丹(Paeoniadelavayi)中CHS基因在類黃酮生物合成中的作用，本研究從滇牡丹中克隆了3條CHS基因，利用生物信息學(xué)手段研究其理化性質(zhì)、序列差異和功能分歧等，并檢測(cè)這3條CHS基因在不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，以期闡明CHS基因在花色形成和表達(dá)中的作用、調(diào)控方式，旨在為利用CHS基因培育黃色觀賞牡丹新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自云南省迪慶州香格里拉市高山植物園(99°21.5″E，27.5′6.9″N)。按株采集不同時(shí)期的黃花樣品并按株區(qū)分保存，3次重復(fù)，用于基因表達(dá)分析；用于轉(zhuǎn)錄組分析的黃花樣品在花開時(shí)采集。采集后樣品迅速置于液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。

1.2 器材與試劑

PCR儀(Biorad， USA)，NanoDropTM 2000 (Thermo，USA)。EasyPfu DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，植物總RNA提取試劑盒(Qiagen)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Thermo，USA)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

用植物總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA，分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量與濃度。選取各樣品中質(zhì)量、濃度合適的總RNA用于合成cDNA的第一條鏈，具體操作步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 CHS基因的克隆

以擬南芥(Arabidopsisthaliana)的CHS基因?yàn)槟０?，?duì)滇牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST以搜索可能的CHS基因，獲得3條可能的CHS基因。根據(jù)這3條基因序列，用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)特異克隆引物，PdCHS1F: 5’-ATGGTGACAGTGGAGGAGAT-3’，PdCHS1R: 5’-ATAGTGCGGCTACTAATTAG-3’；PdCHS2F: 5’-ATGGCTTCAGTTGAAGAAAT-3’，PdCHS2R: 5’-CAATTACAATCAGTGAGTGA-3’；PdCHS3F: 5’-ATGTCGCGCATTCCCACAGC-3’，PdCHS3R: 5’-TCCTTATCCGTAGCCTCTAA-3’。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

以滇牡丹花瓣的cDNA為模板進(jìn)行CHS基因的擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收純化目的片段后，將其連接到pMD18-T克隆載體上，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后，選擇陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 滇牡丹CHS基因的生物信息學(xué)分析

獲得滇牡丹的CHS基因序列后，利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析獲得其氨基酸序列，借助于在線工具ProParam (http: / /web. expasy.org /protparam/)預(yù)測(cè)CHS蛋白的理化性質(zhì)；用SignalP 4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)該蛋白信號(hào)肽；用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)搜索CHS蛋白結(jié)構(gòu)功能域。參考經(jīng)過(guò)功能鑒定的CHS蛋白[14]，與本研究獲得的3條CHS蛋白進(jìn)行聚類分析，用MEGA 6.0中的Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)后，采用鄰位相接法，自檢舉值1 000，其余參數(shù)選用默認(rèn)參數(shù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 滇牡丹CHS基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

根據(jù)3條已獲得的CHS基因，用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物TPdCHS1F: 5’-AACAGTGAGGACAAGGTC-3’，TPdCHS1R: 5’-TTATTTTGGACCAAATGA-3’；TPdCHS2F: 5’-ATAAACAAACGCTATATG-3’，TPdCHS2F: 5’-ATTTATATTAGATGAGAC-3’；TPdCHS3F: 5’-AGACAAGTTATTCCTCAA-3’，TPdCHS3R: 5’-ACTATGGAAATGTGAGTA-3’。以表達(dá)量一致的內(nèi)參基因actin為對(duì)照，對(duì)PdCHS1、PdCHS2、PdCHS3基因在黃色滇牡丹盛花期的雄蕊和不同發(fā)育時(shí)期花中的具體表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，再利用凝膠電泳圖像分析軟件GENE-SNAPS分析其積分光密度，用目的基因/內(nèi)參基因的積分光密度比值在Excel上繪制柱狀圖，對(duì)PdCHS基因的不同表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇牡丹的CHS基因序列

測(cè)序結(jié)果表明，滇牡丹中3條CHS基因的cDNA全長(zhǎng)分別為1 173、1 185、1 128 bp，分別命名為PdCHS1(GenBank登錄號(hào)MK516264)、PdCHS2(GenBank登錄號(hào)MK516265)和PdCHS3(GenBank登錄號(hào)MK516266)；它們均編碼完整的開放閱讀框，長(zhǎng)度分別為390、394、375 aa，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均為CHS；在蛋白序列一致性方面，PdCHS1和PdCHS2的一致性為84.52%，PdCHS1和PdCHS3的一致性為39.34%，PdCHS2和PdCHS3的一致性為39.09%。滇牡丹的這3個(gè)查爾酮合成酶蛋白保守性較高(圖1)，均含有查爾酮合成酶的高度保守序列VGQALFGDGAAAI(PdCHS3僅有1個(gè)氨基酸不同，為VGAALFGDGAAAV)和HPGGPAIL，以及Cys-His-Asn(C-H-N)3個(gè)氨基酸組成的三聯(lián)體活性中心，2個(gè)極度保守的苯丙氨酸殘基F215和F265，這些部位與查爾酮合成酶的底物特異性有關(guān)[15]。此外，PdCHS還含有查爾酮合成酶催化活性部位，PdCHS1和PdCHS2含有查爾酮合成酶活性位點(diǎn)基序(GFGPG)，PdCHS3的活性位點(diǎn)基序?yàn)锳FGPG，3個(gè)蛋白序列的催化活性基序僅有1個(gè)氨基酸差異(圖1)，已通過(guò)氨基酸定點(diǎn)突變確定[16]。

2.2 滇牡丹CHS蛋白的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果(表1)顯示：3個(gè)CHS蛋白的氨基酸殘基數(shù)量為375～394 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為41.2～43.3 ku；PdCHS1為穩(wěn)定蛋白，PdCHS2和PdCHS3為不穩(wěn)定蛋白，這3個(gè)蛋白均為疏水性蛋白，不存在信號(hào)肽。分子系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2)顯示：這3個(gè)蛋白屬于不同的分支，其中，PdCHS1與木薯(Manihotesculenta， XP_021608720)、橡膠(Heveabrasiliensis， XP_021648729)、小桐子(Jatrophacurcas， NP_001295723)一起聚在Ⅰa分支，編碼柚皮素查爾酮合成酶，可能參與柚皮素(Naringenin)的生物合成；PdCHS2與擬南芥(Arabidopsisthaliana， NP_196897)、琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata， XP_002871591)、蕓香(Rutagraveolens， CAC14059)和柑橘(Citrussinensis， NP_001306986)聚在分支Ⅲ，編碼芪合成酶，可能參與白藜蘆醇(resveratrol)的生物合成；PdCHS3與歐洲栓皮櫟(Quercussuber， XP_023913768)、小桐子(J.curcas， XP_020538589)和橡膠(H.brasiliensis， XP_021683368)聚在分支Ⅳ，編碼Ⅲ型聚酮合酶，可能參與三角狀五肽類化合物的生物合成。

●，Cys-His-Asn 三聯(lián)活性中心；◆，苯丙氨酸殘基Phe (F215和F265)；ELKLGL，丙二酰輔酶A結(jié)合域；GFGPG，催化活性基序?！跞Τ龅臑镃HS高度保守序列。●， Cys-His-Asn triple active center; ◆， Phenylaanine residues Phe (F215 and F265); ELKLGL， Malonyl-CoA binding region; GFGPG， Catalytic activities motif. □ indicated highly conserved sequence in CHS.圖1 PdCHS氨基酸序列比對(duì)分析Fig.1 Alignment of PdCHS amino acids sequences

表1 滇牡丹3個(gè)查爾酮合成酶的生物信息學(xué)分析

Table1Bioinformatics analysis of three chalcone synthases fromPaeoniadelavayi

蛋白Proteins氨基酸數(shù)量Number ofamino acids/aa相對(duì)分子質(zhì)量Molecularweight/u分子式Formula不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)Instabilityindex(Ⅱ)脂肪族系數(shù)Aliphaticindex總平均疏水性Grand averageof hydropathicity信號(hào)肽Signalpeptide細(xì)胞定位CelllocationPdCHS139042508.24C1890H3037N509O559S2136.4894.00-0.036無(wú)NoCytoplasmPdCHS239443274.98C1933H3095N517O572S1740.6393.81-0.115無(wú)NoCytoplasmPdCHS337541247.66C1843H2952N494O544S1645.5495.73-0.086無(wú)NoCytoplasm

2.3 滇牡丹CHS基因的表達(dá)模式

滇牡丹中3條CHS基因表達(dá)結(jié)果(表2)顯示：除初花期外，末花期、盛花期、花蕾期、雄蕊3條CHS基因表達(dá)量差異均達(dá)極顯著水平。在不同發(fā)育時(shí)期，3條基因的表達(dá)差異顯著性不同。其中，PdCHS1基因在各發(fā)育時(shí)期表達(dá)量差異極顯著；除初花期和末花期差異不顯著外，其他發(fā)育時(shí)期PdCHS2基因表達(dá)差異達(dá)極顯著水平；PdCHS3基因在初花期、盛花期和雄蕊中表達(dá)無(wú)顯著差異，其他發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異均極顯著。具體表現(xiàn)為：在不同花發(fā)育時(shí)期，PdCHS1基因在花花蕾期最高，隨著花的發(fā)育其表達(dá)量迅速降低，初花期、盛花期、末花期逐漸降低，但盛花期雄蕊中該基因表達(dá)量高于其他時(shí)期的花；隨著花的發(fā)育，PdCHS2基因表達(dá)量呈現(xiàn)升高、降低再升高的趨勢(shì)，具體表達(dá)量為末花期>初花期>盛花期>雄蕊>花蕾期；PdCHS3基因則出現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，其具體表達(dá)量為末花期>花蕾期>盛花期>雄蕊>初花期。

圖2 滇牡丹CHS蛋白與其他植物CHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Dendrogram of CHS protein in Paeonia delavayi and other CHSs from higher plants

表2 不同花發(fā)育時(shí)期PdCHS基因的表達(dá)量

Table2PdCHSgene expression difference between multi-developmental periods of flowers

基因Genes花蕾期Budding stage初花期Initial flowering stage盛花期Full-bloom stage末花期Blosom falling stage雄蕊StaminaPdCHS14.11±0.26 Ab0.87±0.11 Ac0.53±0.02 Cd0.26±0.01 Ae5.16±0.12 AaPdCHS20.24±0.03 Cd0.90±0.04 Aa0.72±0.03 Bb0.94±0.12 Ba0.35±0.01 CcPdCHS31.91±0.13 Bb0.92±0.05 Ac1.08±0.11 Ac2.61±0.14 Aa1.07±0.26 Bc

同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同大寫字母代表基因在相同發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平差異極顯著(P<0.01)，同行數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫字母代表同一基因在不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平差異極顯著(P<0.01)。

Data marked without the same uppercase letter in each column indicated expression differences of genes in the same developmental period were significant atP<0.01. Data marked without the same lowercase letter in each row indicated expression differences of the same gene in the different developmental periods were significant atP<0.01.

3 結(jié)論與討論

CHS在不同物種間的基因序列長(zhǎng)度差異較小，同源性較高，蛋白序列高度保守[7，17]。各物種中均可分離出數(shù)個(gè)CHS基因[18-19]。迄今為止，在NCBI上已注冊(cè)超過(guò)5 000條與CHS有關(guān)的基因序列，從不同植物中分離鑒定出超過(guò)650個(gè)CHS家族基因[20]，這些基因所編碼的蛋白質(zhì)基本為穩(wěn)定的單鏈?zhǔn)杷缘鞍?，定位于?xì)胞質(zhì)基質(zhì)中[17，21]。本研究從滇牡丹中分離純化的3個(gè)CHS基因(PdCHS1、PdCHS2、PdCHS3)與前述的研究結(jié)果一致，但在穩(wěn)定性方面，僅有PdCHS1為穩(wěn)定蛋白，PdCHS2和PdCHS3均為不穩(wěn)定蛋白。在同一物種中，分離得到的CHS基因的功能相似，如蘋果中的MdCHS1、MdCHS2、MdCHS3均行使CHS功能[11]，而本研究從滇牡丹中分離的3個(gè)CHS基因功能卻存在一定的差異。

CHS參與植物類黃酮的生物合成[22]，能限制類黃酮后續(xù)生物合成的通量[11]；類黃酮的生物合成受多重因素影響，其累積程度可影響花色深淺[23-24]，具明顯的種群、種屬特性[25]。本研究以開黃花的滇牡丹為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，CHS基因在花發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量有差異，同一時(shí)期不同CHS基因的表達(dá)量也存在較大差異，推測(cè)CHS基因表達(dá)量的變化可導(dǎo)致植物體內(nèi)類黃酮累積程度不同，進(jìn)一步影響植物花色[10，26]；同一植物中不同CHS基因在不同環(huán)境、組織的表達(dá)量均存在顯著差異[6，11，27]，如角堇(Violacornuta)CHS基因在光照條件下的表達(dá)量遠(yuǎn)高于暗環(huán)境[6]，蘋果的CHS基因在不同組織中表達(dá)量不同[11]。本研究中滇牡丹的3個(gè)CHS基因表達(dá)量存在顯著差異，可能與各基因參與不同的次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)。其中，PdCHS1基因在花發(fā)育初期表達(dá)量最高，可能與其負(fù)責(zé)查爾酮合成相關(guān)，與蘋果中的3個(gè)CHS基因在幼嫩組織中表達(dá)量較高一致[11]；PdCHS2基因在花發(fā)育前期表達(dá)量較低、后期升高，可能與其參與芪類化合物生物合成、形成植物抗毒素抵御病蟲害侵襲有關(guān)[16]；PdCHS3基因在花蕾期和末花期表達(dá)量較高，推測(cè)其參與聚酮類化合物的生物合成，可能與提高植物抗性、抵御脅迫和病蟲害侵襲有關(guān)。本研究從滇牡丹中克隆得到3條功能不同、表達(dá)差異顯著的CHS基因，為牡丹花色育種提供了基礎(chǔ)的基因材料，但仍需進(jìn)一步探明這3個(gè)基因在花色形成過(guò)程中的具體功能和作用部位。