姜瑤瑤，李 靜，蔡年俊，陳劍平，張恒木，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310021； 3.寧波大學(xué) 植物病毒學(xué)研究所，浙江 寧波 315211)

植物原纖維蛋白(FBN)又稱(chēng)為脂類(lèi)相關(guān)質(zhì)體蛋白，廣泛存在于低等植物藍(lán)藻到高等植物的光合器官中[1]。20世紀(jì)中葉，科學(xué)家們?cè)诿倒搴屠苯返戎参锛?xì)胞的有色體中觀察到不同厚度的線狀或管狀的原纖維[2]，該結(jié)構(gòu)含有豐富的類(lèi)胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、糖脂和磷脂組分，是有色體中細(xì)胞色素積累的主要場(chǎng)所[3]。直到20世紀(jì)90年代，科學(xué)家們首次從辣椒中分離并克隆出第1個(gè)植物FBN基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白參與植物有色體原纖維結(jié)構(gòu)的組裝[4]。近期的研究顯示，植物FBN基因除了參與有色體原纖維的形成，還與質(zhì)體色素的積累、各類(lèi)脅迫的應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)[5-7]。Rey等[8]在煙草中過(guò)量表達(dá)辣椒FBN基因后，對(duì)其進(jìn)行干旱和強(qiáng)光處理，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于對(duì)照，且花期提前，表明辣椒FBN基因在脅迫條件下能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。但數(shù)十年來(lái)，有關(guān)本氏煙(Nicotianabenthamiana)FBN基因的研究鮮有報(bào)道。為了分析其功能特性，本研究從本氏煙中克隆了一個(gè)NbFBN基因，并對(duì)其特性進(jìn)行了初步的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ購(gòu)自美國(guó)Fermantas MBI公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量PCR所用的SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；引物合成與測(cè)序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 RNA提取和cDNA合成

本氏煙在25 ℃、14 h∶10 h(光/暗)條件下培養(yǎng)，取其根、莖、葉和花器官用于組織特異性分析。干旱處理：向營(yíng)養(yǎng)液中加入適量的PEG 6000固體使其終濃度為5%，同時(shí)用ddH2O作為對(duì)照；脫落酸(ABA)處理：調(diào)節(jié)ABA濃度為100 μmol·L-1，采用噴施處理，然后分別在處理0、12和24 h后采取葉片用于定量分析。取適量植物材料用Trizol試劑(Invitrogen)參照商家說(shuō)明提取植物材料總RNA。取1 μg總RNA作模板，應(yīng)用Oligo(dT)18引物，參照First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.3 NbFBN基因擴(kuò)增和克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中本氏煙FBN序列(登錄號(hào)：XP_016504394.1)，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)了引物NbFBN-F(5’-GGAATTCCATATGGCTACCATCTCTTCTCTA-3’)和NbFBN-R(5’-GCGGATCCTTAAGGCTTCAAGAGGGGAC-3’)，以葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，參照商家說(shuō)明利用PCR產(chǎn)物切膠純化試劑盒(Promega公司)切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物。純化的產(chǎn)物連接至pGEM-T-Easy載體，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，并涂于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將含預(yù)期大小插入片段的克隆送至杭州博尚公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 NbFBN同源性與進(jìn)化分析

為分析NbFBN蛋白和其他植物FBN的同源性，從NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org)中下載了植物FBN基因序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用Neighbor-Joining法，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.5 定量PCR

利用NbFBN基因的引物對(duì)(5’-CTGCTGACAACATACCTGGATGA-3’；5’-TCAACACAAATACACTGCCTCCAT-3’)和本氏煙內(nèi)參基因UBCE2(登錄號(hào)：AB026056.1)引物對(duì)(5’-TGGAGGTACATTTAAGCTGACAC-3’；5’-TCACAGAGCAAAGACTGGATTG-3’)，使用上海翊圣生物科技有限公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix在ABI公司(Applied Biosystems)的儀器7900 Real-Time PCR System，按照如下條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行定量PCR(qPCR)反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 本氏煙NbFBN基因的克隆

以提取的本氏煙葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中本氏煙FBN基因序列(基因登錄號(hào)：XP_016504394.1)設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，得到一條約1 kb的條帶，與預(yù)計(jì)大小相符(圖1)。經(jīng)切膠回收純化后，連接到T5-Bzero載體上，然后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，測(cè)序結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)966 bp，可編碼一個(gè)分子量大小約為35 ku的蛋白。

1，8 000 bp DNA ladder；2，NbFBN.圖1 NbFBN基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR result of NbFBN gene

2.2 本氏煙NbFBN基因同源性分析

目前，擬南芥FBN基因研究的較多，分類(lèi)比較明確[9]。為了確定NbFBN的進(jìn)化地位及其與擬南芥FBN的親緣關(guān)系，我們從數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org)中下載了已知的擬南芥FBN基因序列[9]，并采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，結(jié)果表明，NbFBN與擬南芥FBN1a、FBN1b聚在一起(圖2)，表明本研究克隆的NbFBN與擬南芥FBN1a、FBN1b親緣關(guān)系最近，應(yīng)同屬于FBN類(lèi)型I的成員。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NbFBN還與番茄(Solanumlycopersicum)、枸杞(Lyciumruthenicum)、甜椒(Capsicumannuum)等植物的FBN基因存在較高的同源性(62.54%～87.20%)，相比之下，該基因的C-端部分(112-321位氨基酸)尤為保守(圖3)。

2.3 NbFBN組織特異性表達(dá)分析

為了研究NbFBN基因在不同組織器官中的表達(dá)水平，利用定量PCR測(cè)定了NbFBN基因在本氏煙的根、莖、葉和花中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)NbFBN基因在本氏煙葉片、花中的表達(dá)量相對(duì)較高，而在根、莖中的表達(dá)量較低。

AtFBN4、AtFBN8、AtFBN9、AtFBN5、AtFBN10、AtFBN6、AtFBN3a、AtFBN3b、AtFBN7a、AtFBN7b、AtFBN11、AtFBN2、AtFBN1b、AtFBN1a均來(lái)自擬南芥。NbFBN來(lái)自本氏煙。AtFBN4， AtFBN8， AtFBN9， AtFBN5， AtFBN10， AtFBN6， AtFBN3a， AtFBN3b， AtFBN7a， AtFBN7b， AtFBN11， AtFBN2， AtFBN1b and AtFBN1a from Arabidopsis thaliana; NbFBN from Nicotiana benthamiana.圖2 NbFBN與擬南芥FBN基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic relationship of NbFBN and FBNs from Arabidopsis thaliana

SlFBN(NP_001234183.1，番茄)；LrFBN(AIX87535.1，枸杞)；CaFBN(AIX02791.1，甜椒)；AtFBN1a(AT4G04020，擬南芥)和AtFBN1b(AT4G22240，擬南芥)。SlFBN(NP_001234183.1， Solanum lycopersicum)， LrFBN(AIX87535.1， Lycium ruthenicum)， CaFBN(AIX02791.1， Capsicum annuum)， AtFBN1a(AT4G04020， Arabidopsis thaliana) and AtFBN1b(AT4G22240， Arabidopsis thaliana).圖3 NbFBN與其他植物FBN基因的多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of NbFBN and other FBN genes from different plants

*表示與葉片相比在P<0.05水平差異顯著；ns表示與葉片相比差異不顯著。* meant significant difference at the level of P<0.05 compared with leaf. ns meant no significant difference compared with leaf.圖4 本氏煙不同部位NbFBN表達(dá)分析Fig.4 Relative expression level of NbFBN in different tissues of Nicotiana benthamiana

*表示與0 h相比在P<0.05水平差異顯著；ns表示與0 h相比差異不顯著。* meant significant difference at the level of P<0.05 compared with 0 h. ns meant no significant difference compared with 0 h.圖5 PEG與ABA處理下NbFBN的表達(dá)特性Fig.5 Expression of NbFBN in response to PEG and ABA stresses

2.4 逆境下NbFBN基因的表達(dá)模式

為分析逆境條件下NbFBN基因的表達(dá)特性，我們分別對(duì)本氏煙進(jìn)行PEG、激素ABA噴施處理，然后采用定量PCR分析了NbFBN基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，PEG處理12 h時(shí)，NbFBN的表達(dá)量未見(jiàn)明顯上升；處理24 h后，表達(dá)量顯著上升，約是處理前的7倍；ABA處理12 h后，NbFBN表達(dá)量達(dá)到最高，處理24 h后NbFBN表達(dá)量繼續(xù)維持在較高水平，表明NbFBN受到PEG、ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與植物的逆境響應(yīng)過(guò)程，NbFBN的表達(dá)水平可能與抗(耐)旱性密切相關(guān)。

3 討論

植物原纖維蛋白(FBN)是由核基因組編碼的質(zhì)體蛋白，與質(zhì)體原纖維、葉綠體類(lèi)囊體、光合天線復(fù)合物相關(guān)。因此，對(duì)植物FBN蛋白的研究有助于更好地理解質(zhì)體結(jié)構(gòu)和功能的機(jī)制[10-12]。本氏煙作為一種模式植物，是研究植物與生物、非生物逆境互作的優(yōu)良材料，但我們對(duì)其FBN的生物學(xué)功能和作用機(jī)制知之甚少。不同植物的原纖維蛋白呈現(xiàn)出不同的組織特異性，如在馬鈴薯根、莖、葉中檢測(cè)到C40.4(FBN1)轉(zhuǎn)錄物[13]，其在葉片中最豐富[14]；擬南芥FBN1a主要在葉的葉肉和保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[5]。本研究表明，NbFBN基因與番茄、枸杞、辣椒FBN高度同源，且在本氏煙根、莖、葉、花中均有表達(dá)(圖4)；相比之下，NbFBN基因在葉、花中的表達(dá)量較高，而在根、莖中的表達(dá)量最低，這與擬南芥FBN1a、馬鈴薯C40.4(FBN1)的表達(dá)特點(diǎn)相似，支持其同屬于FBN類(lèi)型Ⅰ的推論，也暗示NbFBN可能與擬南芥FBN1a在質(zhì)體原纖維形成過(guò)程中具有相似的功能。近期的研究還顯示，F(xiàn)BN參與了植物抗逆反應(yīng)[15-22]，例如，生長(zhǎng)素(IAA)延遲了辣椒果實(shí)中原纖維蛋白(FBN1)積累，而脫落酸(ABA)則促進(jìn)其FBN1的積累[22]；在擬南芥中，ABA處理可誘導(dǎo)FBN1a蛋白的積累，從而保護(hù)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)免受光抑制[23]。在本研究中，NbFBN在干旱和ABA處理時(shí)表達(dá)水平均升高，這與擬南芥FBN1a、FBN1b表達(dá)特點(diǎn)相似[23]，表明該基因可能參與逆境響應(yīng)過(guò)程。然而，干旱、ABA等逆境條件誘導(dǎo)植物FBN基因表達(dá)的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，本文有關(guān)NbFBN基因表達(dá)特點(diǎn)的結(jié)果有助于深入研究其生物學(xué)功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。