范張玲， 肖 盟， 王怡倩， 徐英春， 葉長(zhǎng)蕓， 王煥玲

單核細(xì)胞增生李斯特菌（L i s t e r i a monocytogenes， LM）為革蘭陽(yáng)性、兼性胞內(nèi)寄生菌，可通過(guò)食物傳播，導(dǎo)致李斯特菌病[1]。目前國(guó)際上已有多起LM污染食物引起李斯特菌病暴發(fā)的報(bào)道，如蘋(píng)果、香瓜、冰激凌、奶酪、肉食等[2-3]，美國(guó)等曾通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分型等方法成功溯源多起暴發(fā)，及時(shí)召回污染食物，避免更多人群感染[4]。我國(guó)不同省份食物中LM檢出率約為4.42%，除嬰兒食物、烘培食物、雞蛋外，幾乎所有食物中均分離到LM[5]，說(shuō)明我國(guó)有很大的李斯特菌病潛在風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)2010-2017年共報(bào)道了562例李斯特菌感染病例，而暴發(fā)病例報(bào)道罕見(jiàn)[6]。

美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已將李斯特菌病歸為法定傳染病，而我國(guó)僅部分省市開(kāi)展了李斯特菌監(jiān)測(cè)工作，李斯特菌病目前在我國(guó)尚未引起足夠的關(guān)注[5]。北京協(xié)和醫(yī)院李斯特菌病患者臨床分析數(shù)據(jù)顯示，有44%李斯特菌病患者為醫(yī)院感染病例[7]。本研究分析了我院18例LM感染患者臨床特征，并通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）方法，對(duì)18株LM進(jìn)行同源性分析，探討LM感染患者與LM菌株間的相關(guān)性，以期提高臨床醫(yī)師對(duì)該病的關(guān)注和認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 患者信息及菌株來(lái)源

本研究納入的18株LM均分離自我院2006年1月-2019年4月臨床確診病例，菌株來(lái)源包括外周血（11例）、腦脊液（6例）、宮腔拭子（1例）。非妊娠患者出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、腹瀉、惡心嘔吐、意識(shí)改變等LM感染表現(xiàn)；妊娠患者出現(xiàn)發(fā)熱、流產(chǎn)等LM感染表現(xiàn)。沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。

1.2 主要儀器與試劑

凝膠成像系統(tǒng)GEL Doc XR和PFGE儀CHEF DR-Ⅲ均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；比濁儀Densimat為法國(guó)BioMerieux VITEK公司產(chǎn)品；水浴搖床Grant OLS2000為英國(guó)Grant公司產(chǎn)品。

主要試劑有SeaKem Gold Agarose（美國(guó)LONZA公司）；蛋白酶K（德國(guó)Merck），溶菌酶（美國(guó)Sigma），限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、AscⅠ、Apa I（美國(guó)NEB）。引物由北京瑞博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 臨床李斯特菌病患者數(shù)據(jù)收集 檢索我院臨床分離菌株庫(kù)內(nèi)的LM菌株，并通過(guò)對(duì)應(yīng)患者的病案號(hào)檢索我院病案室患者資料，收集患者年齡、性別、基礎(chǔ)情況、發(fā)病時(shí)間、感染類(lèi)型、臨床轉(zhuǎn)歸等信息。

1.3.2 血清學(xué)分型及毒力基因 采用多重PCR方法鑒定菌株的血清型[8]，PCR方法鑒定菌株攜帶毒力基因情況[9]：inlA（編碼內(nèi)化素A）、ActA（編碼肌動(dòng)蛋白A）、PrfA（編碼毒力調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄活化因子）、hly（編碼溶毒素LLO）、iap（編碼細(xì)胞壁水解酶p60）、PlcB（編碼磷脂酰膽堿磷脂酶PC-PLC）。所測(cè)定的基因及擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s， 53 ℃退火30 s， 72 ℃延伸90 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳，并觀察電泳結(jié)果。

1.3.3 PFGE分型 按照美國(guó)CDC PulsNet標(biāo)準(zhǔn)操作步驟[10]，用Apa I和Asc I兩種酶切LM基因，沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812使用XbaⅠ酶切；設(shè)置電泳參數(shù)初始轉(zhuǎn)換時(shí)間4 s、終末轉(zhuǎn)換時(shí)間40 s、電泳運(yùn)行19.5 h；用溴化乙錠染色后使用凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+拍攝圖像，將結(jié)果上傳至BioNumerics系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖。聚類(lèi)圖類(lèi)型根據(jù)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法 （UPGMA） 構(gòu)建。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 使用E試驗(yàn)方法（采用法國(guó)生物梅里埃公司E試驗(yàn)條），按照臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作流程測(cè)定LM菌株對(duì)青霉素和美羅培南的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 患者基本信息

18例李斯特菌病患者的基本信息見(jiàn)表2。其中，妊娠相關(guān)病例4例，2例死胎。14例非妊娠相關(guān)病例中，男女各7例；年齡19～77歲，其中7例年齡＞50歲；3例預(yù)后不良。所有患者均表現(xiàn)發(fā)熱，以高熱為主。

4例妊娠相關(guān)病例的孕產(chǎn)婦血培養(yǎng)均有LM生長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，均未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀。第1例新生兒為早產(chǎn)兒，表現(xiàn)為血流感染、腦膜炎，出生后即出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征，經(jīng)青霉素聯(lián)合美羅培南治療后好轉(zhuǎn)出院。第2例患者孕早期感染LM，發(fā)熱第2天血培養(yǎng)LM生長(zhǎng)，經(jīng)及時(shí)診斷治療后好轉(zhuǎn)出院。而第13和16例患者，分別為孕中期和孕晚期病例，入院時(shí)即診斷為宮內(nèi)死胎，經(jīng)引產(chǎn)、治療后好轉(zhuǎn)出 院。

14例非妊娠相關(guān)LM病患者均患有基礎(chǔ)疾病，包括自身免疫病7例、腫瘤4例、2型糖尿病2例、心臟病2例。第5、14例患者因病情較重家屬放棄治療，第17例患者因合并開(kāi)放性肺結(jié)核轉(zhuǎn)院后死亡。

2.2 PFGE分型分析

18株LM的PFGE分型結(jié)果見(jiàn)圖1，共出現(xiàn)13個(gè)帶型，均為數(shù)據(jù)庫(kù)中已有帶型。相似度為57.69%～100%。第10、13、16株菌和第1、4株菌雖條帶差異度大于1%，但聯(lián)合Apa I帶型和數(shù)據(jù)庫(kù)中已有帶型分析發(fā)現(xiàn)此5株屬同一帶型，為GX6A16.CN0030，但無(wú)明顯時(shí)間聚集性。第3和第17株菌為同一帶型。

2.3 6例入院48 h后起病患者詳細(xì)特征分析

2.3.1 患者基本情況 6例患者（表2第4、5、7、10、11和12例），4例女性，年齡24～61歲。6例患者均患有基礎(chǔ)疾病，3例因自身免疫病住院，2例因血液腫瘤住院，1例因消化道腫瘤入院，血培養(yǎng)均有LM生長(zhǎng)，3例表現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀。如表2所示，6例李斯特菌病患者無(wú)明顯病房聚集性，分布在5個(gè)病房。第5例患者因臨床表現(xiàn)較重，家屬放棄治療，出院。

2.3.2 血清學(xué)分型及毒力基因攜帶情況 6株臨床分離LM株血清及毒力基因攜帶情況見(jiàn)圖2，2株血清型為1/2b（1/2b-3b-7），4株血清型為1/2a（1/2a-3a）。所有菌株的毒力基因inlA、ActA、PrfA、hly、iap均為陽(yáng)性，而第4、10株菌的毒力基因PlcB陰性。

2.3.3 PFGE分型結(jié)果 6株LM的PFGE結(jié)果如圖1的第4、5、7、10、11、12例結(jié)果所示。其中第4和第10號(hào)菌株相似度雖小于99%，但結(jié)合ApaI圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)中已有條帶分析，將其歸為同一帶型GX6A16.CN0030。另有3例出現(xiàn)在2010年，但PFGE型別不同。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

18株臨床分離LM對(duì)青霉素和美羅培南敏感率均為100%。

3 討論

李斯特菌病患者以老年人、孕婦、免疫功能低下者為主[11]，臨床表現(xiàn)多較重，可表現(xiàn)為血流感染、腦膜炎、新生兒李斯特菌病等，病死率30%左右[12]。孕婦感染LM臨床表現(xiàn)較新生兒輕，多表現(xiàn)為發(fā)熱和流感樣癥狀，29%產(chǎn)婦沒(méi)有癥狀，罕見(jiàn)孕婦腦膜炎或死亡病例報(bào)道，而流產(chǎn)、新生兒李斯特菌病發(fā)生率較高，新生兒李斯特菌病病死率可達(dá)40%[13-14]。本研究4例妊娠相關(guān)病例中，2例死胎。14例非妊娠相關(guān)病例均患有基礎(chǔ)疾病，以自身免疫性疾病為主，7例年齡＞ 50歲。

圖2 6例入院48 h后起病患者LM菌株毒力基因及血清型結(jié)果Figure 2 Virulence gene and serotype of LM isolates in 6 patients with nosocomial infection

臨床研究發(fā)現(xiàn)LM感染患者多伴有免疫功能低下等疾病，LM與宿主間相互作用機(jī)制尚不清楚，有觀點(diǎn)認(rèn)為免疫功能低下者感染LM更易表現(xiàn)為侵襲性感染，如血流感染、腦膜炎等，但對(duì)比患與不患有免疫功能低下疾病的LM感染患者，并未發(fā)現(xiàn)發(fā)生侵襲性感染的差異[6]。本研究14例非妊娠患者均伴有基礎(chǔ)疾病，7例患有自身免疫病，4例患有惡性腫瘤，均表現(xiàn)為侵襲性感染，11例出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀。對(duì)比我國(guó)2010-2017年和1996-2010年報(bào)道的LM感染病例，發(fā)現(xiàn)LM感染病例數(shù)顯著增加，提示我國(guó)李斯特菌感染被低估的可能[6]。韓國(guó)亦報(bào)道了李斯特菌感染病例較前增加的情況，增加的病例以老年人和伴有基礎(chǔ)疾病者為主[15]。

在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，李斯特菌病已被列為法定傳染病，由李斯特菌引起的疾病負(fù)擔(dān)在多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道分析[15-17]，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室分型方法已成功溯源多起暴發(fā)，避免更多人群感染。我國(guó)李斯特菌病尚未被列為法定傳染病，報(bào)道的病例數(shù)有限，不排除低估的可能，暴發(fā)病例更是罕見(jiàn)[6]。我國(guó)山東省疾控中心在LM感染患者家庭及周邊超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、路邊快餐等處采集食品類(lèi)樣品并進(jìn)行菌株分離，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查和PFGE分型等方法，成功溯源三黃雞為污染源[18]。此外，北京等地區(qū)將分離自患者和食物中的LM菌株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)臨床菌株與分離自周?chē)澄锏木晖耆嗤琜19-20]。

本研究中18例患者的PFGE圖譜中，優(yōu)勢(shì)圖譜為GX6A16.CN0030（27.78%）。分別有5株、2株菌株為同一帶型。GX6A16.CN0013、GX6A16.CN0017和GX6A16.CN0030帶型臨床分離株亦在北京市其他醫(yī)院報(bào)道[20-21]。同為入院48 h后發(fā)病的6例患者中，由于本研究為回顧性研究，較難追溯患者流行病學(xué)史及可疑食物史，但有2例PFGE圖譜雖差異度大于1%，但血清型和毒力基因攜帶情況一致，不排除醫(yī)院周?chē)澄镂廴镜目赡苄?。提示?yīng)開(kāi)展醫(yī)院內(nèi)LM監(jiān)測(cè)工作，避免免疫力低下人群發(fā)生LM感染。

李斯特菌感染多累及老人、孕婦、新生兒和免疫功能低下患者，臨床醫(yī)師需引起重視。當(dāng)經(jīng)驗(yàn)用藥未果時(shí)，需考慮是否為L(zhǎng)M感染。目前，青霉素類(lèi)如青霉素、氨芐西林仍是治療LM感染的首選藥物，該菌對(duì)頭孢菌素天然耐藥。對(duì)于青霉素過(guò)敏的患者，可首選甲氧芐啶-磺胺甲唑。本組18例感染患者的LM對(duì)青霉素和美羅培南高度敏感，無(wú)不敏感株。初始經(jīng)驗(yàn)用藥使用頭孢菌素類(lèi)者有7例患者，后改用和加用氨芐西林或青霉素和/或磺胺類(lèi)，有些患者加用了亞胺培南，患者治愈和好轉(zhuǎn)。因此若抗菌藥物使用合理，感染預(yù)后良 好。