曹 恒，楊 帥，白俊艷，樊紅燈，龐有志，付學(xué)言，盧小寧，時(shí)坤鵬

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

鵪鶉是一種古老的鳥(niǎo)類，在全球各地分布十分廣泛，品種繁多[1]。鵪鶉的肉和蛋具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，相較于烏雞蛋和普通雞蛋，鵪鶉蛋蛋白質(zhì)含量最高，且磷脂含量也較高[3]，故有卵中佳品的美稱[4]。由于影響鵪鶉生產(chǎn)性能和繁殖性能的因素很多，且其遺傳力低[5]，通過(guò)常規(guī)選育進(jìn)展較為緩慢。近年來(lái)，分子標(biāo)記遺傳育種的研究正蓬勃發(fā)展，成為了品種選育與改良的一大新興技術(shù)。TSUDZUKI[6]對(duì)鵪鶉毛色、喙形、腳趾形態(tài)及蛋殼顏色等形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行了研究。付晶等[7]篩選出能夠準(zhǔn)確鑒別鵪鶉性別的CHD基因標(biāo)記;白俊艷等[8]和吳勝軍等[9]利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了鵪鶉群體的多態(tài)性;王旭等[10]利用生物信息學(xué)方法分析了鵪鶉的EST-SSR多態(tài)性。雌激素受體基因(Estrogen receptor gene，ESR)，在1962年由JENSEN等[11]發(fā)現(xiàn)，其影響雌性動(dòng)物的第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠維持等，影響胚胎發(fā)育和系統(tǒng)分化。通常情況下，雌激素受體有2種亞型，即ESRα和ESRβ， 分別由不同的基因編碼，介導(dǎo)雌激素的多項(xiàng)效應(yīng)。作為畜禽繁殖過(guò)程中的一個(gè)重要影響因子，ESR1(ESRα)基因在子宮和乳腺中起主導(dǎo)作用[12]。眾多學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展雌激素受體在人類、豬、雞、牛、綿羊、豚鼠等動(dòng)物上的研究工作[13-15]，但是ESR1基因與鵪鶉生長(zhǎng)發(fā)育性能的關(guān)聯(lián)分析未見(jiàn)報(bào)道，為此，以3個(gè)蛋用鵪鶉品種為受試對(duì)象，利用PCR-RFLP技術(shù)，分析ESR1基因外顯子1與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)性，以期為鵪鶉的標(biāo)記選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 血液采集及基因組DNA提取 供試動(dòng)物為北京白羽鵪鶉50羽、中國(guó)黃羽鵪鶉50羽、朝鮮鵪鶉50羽，采用心臟采血法進(jìn)行采血，將血液儲(chǔ)存在含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，放至-20 ℃的冰箱進(jìn)行冷凍保存以備使用。采用試劑盒法提取鵪鶉的基因組DNA，家禽全血基因組DNA提取試劑盒由鄭州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2ESR1基因外顯子1引物合成ESR1基因外顯子1引物序列參考蒲躍進(jìn)[16]方法設(shè)計(jì)， 由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成，引物序列:F:CAAAGCCTCTGGAGTTAC，R:AGCAGTTTCCCTCAT-

CCC，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為370 bp。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ESR1基因外顯子1的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系共15 μL：上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA1.0 μL，2×TaqPCR Mix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

1.2.2ESR1基因外顯子1的PCR-RFLP檢測(cè)ESR1引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行的酶切反應(yīng)體系為15 μL：ddH2O 5 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(10 U/μL) 0.5 μL，10×Buffer 1.5 μL?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃水浴消化4 h。酶切產(chǎn)物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，額定電壓100 V，額定電流100 mA。電泳結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并記錄每個(gè)個(gè)體的基因型。

1.2.3ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析 關(guān)聯(lián)分析模型：yijk=μ+Bi+Mj+eijk,式中yijk為性狀表型值，μ為總體均值，Bi為第i個(gè)品種效應(yīng)(i=1，2，3)，Mj為第j種基因型效應(yīng)，eijk為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESR1基因外顯子1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

ESR1基因外顯子1在3個(gè)鵪鶉群體中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，檢測(cè)結(jié)果為唯一的明亮條帶，無(wú)雜帶和脫尾現(xiàn)象，片段大小約為370 bp。

M.DL2000 Marker; 1—2.中國(guó)黃羽鵪鶉;3—4.北京白羽鵪鶉; 5.朝鮮鵪鶉

2.2 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性檢測(cè)

圖2是ESR1基因外顯子1多態(tài)性在3個(gè)鵪鶉群體中的部分檢測(cè)結(jié)果。從圖2可以看出，ESR1基因外顯子1在鵪鶉群體中能檢測(cè)到3種基因型，即為T(mén)T基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(370 bp/330 bp/40 bp)。

M.DL2000 Marker; (A).中國(guó)黃羽鵪鶉; (B).北京白羽鵪鶉; (C).朝鮮鵪鶉;3、8為T(mén)T基因型;1、2、11、12、13、14、18為CC基因型;4、5、6、7、9、10、15、16、17為CT基因型

2.3 ESR1基因外顯子1的測(cè)序分析

將鵪鶉ESR1基因外顯子1的CC、CT、TT這3種基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示，在312 bp出現(xiàn)C/T突變，95 bp出現(xiàn)C/T突變，圖3是95 bp處的C/T突變結(jié)果。

圖3 ESR1基因外顯子1的不同基因型測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of different genotypes of exon 1 of ESR1 gene

2.4 ESR1基因外顯子1的基因頻率和基因型頻率

ESR1基因外顯子1在3個(gè)蛋用鵪鶉群體中的基因型頻率和基因頻率等多態(tài)信息結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，ESR1基因外顯子1在中國(guó)黃羽鵪鶉、北京白羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉中都以CC基因型頻率為最高，CC基因型頻率分別為0.515、0.600、0.723，ESR1基因外顯子1在3個(gè)蛋用鵪鶉群體中C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。中國(guó)黃羽鵪鶉的遺傳多樣性相對(duì)較大[雜合度(He)為0.409]，北京白羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉的遺傳多樣性較小。ESR1基因外顯子1在朝鮮鵪鶉群體中為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量(PIC)<0.25]，在中國(guó)黃羽鵪鶉和北京白羽鵪鶉群體為中度多態(tài)(0.25

表1 ESR1基因外顯子1的遺傳多態(tài)性Tab.1 Genetic polymorphism of exon 1 of ESR1 gene

2.5 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)性分析

由表2可以看出，3周齡時(shí)，朝鮮鵪鶉的CT基因型的脛長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)顯著高于CC基因型(P<0.05)；5周齡時(shí)，朝鮮鵪鶉的CT基因型的胸骨長(zhǎng)和脛圍顯著性高于CC基因型(P<0.05)。可見(jiàn)，ESR1基因外顯子1與朝鮮鵪鶉的脛長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)、脛圍有相關(guān)性(P<0.05)。

5周齡時(shí)，北京白羽鵪鶉的TT基因型體質(zhì)量顯著性高于CC基因型(P<0.05)?？梢?jiàn)，ESR1基因外顯子1與北京白羽鵪鶉的體質(zhì)量有相關(guān)性(P<0.05)。

5周齡時(shí)，中國(guó)黃羽鵪鶉的CC基因型的體質(zhì)量、胸深、胸骨長(zhǎng)顯著高于TT基因型(P<0.05)。7周齡時(shí)，中國(guó)黃羽鵪鶉CC基因型的體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸深、體長(zhǎng)顯著高于TT基因型(P<0.05)。可見(jiàn)，ESR1基因外顯子1與中國(guó)黃羽鵪鶉的體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸深、體長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)有相關(guān)性(P<0.05)。

表2 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Association of ESR1 gene exon 1 polymorphism with early growth performance in quails

注：同周齡同列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫(xiě)英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters at the same week in the same column mean the significant difference(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

在對(duì)家禽ESR基因多態(tài)性的研究上，季華員等[17]研究了ESR1基因在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞群體中的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在外顯子1有5個(gè)突變位點(diǎn)，外顯子4和8各有1個(gè)突變位點(diǎn)。王洪才等[18]研究了莊河大骨雞ESR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了CC、CD、DD基因型。周瑩瑩等[19]對(duì)蛋用黑羽鵪鶉ESR基因外顯子的多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明,ESR基因外顯子1、3、4、6、8中均存在多態(tài)性。本研究在3個(gè)鵪鶉品種的ESR1基因外顯子1上共發(fā)現(xiàn)了2個(gè)突變位點(diǎn)，分別為C95T位點(diǎn)和C312T位點(diǎn)，檢測(cè)到3種基因型(TT、CC和CT)，這與蒲躍進(jìn)[16]的研究結(jié)果相同。3個(gè)鵪鶉品種的等位基因C的頻率均在0.7以上，為優(yōu)勢(shì)等位基因，這一結(jié)果與周瑩瑩等[19]的結(jié)果相同。ESR1基因外顯子1在3個(gè)鵪鶉品種中都有著較小的遺傳多樣性(He<0.5)。朝鮮鵪鶉群體為低度多態(tài)(PIC<0.25)，中國(guó)黃羽鵪鶉和北京白羽鵪鶉群體為中度多態(tài)(0.25

畜禽的繁殖性能(產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)仔數(shù))是畜禽重要的經(jīng)濟(jì)性狀，對(duì)于母畜來(lái)說(shuō)一般也將其繁殖性能作為目標(biāo)性狀進(jìn)行選種。家禽體內(nèi)的雌激素具有控制排卵期卵泡的生長(zhǎng)及卵黃的生成、參與蛋殼形成及產(chǎn)卵活動(dòng)、刺激雞輸卵管發(fā)育等功能。ESR基因作為雌激素發(fā)揮作用的重要因子，同樣參與了雌激素作用的生理過(guò)程。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)ESR基因的研究主要集中在與畜禽繁殖性能的關(guān)聯(lián)上，于吉英等[20]研究表明，ESR基因的多態(tài)性與300日齡文昌雞產(chǎn)蛋數(shù)存在顯著性相關(guān)(P<0.05)。王文濤等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因?qū)η瓥|南小香雞的產(chǎn)蛋性狀具有顯著性的影響(P<0.05)。王洪才等[18]研究發(fā)現(xiàn)，莊河大骨雞ESR基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋數(shù)、蛋料比存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。周瑩瑩等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因外顯子1與蛋用黑羽鵪鶉的開(kāi)產(chǎn)日齡存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)。蒲躍進(jìn)[16]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因外顯子1與鵪鶉的開(kāi)產(chǎn)日齡存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)。曹晶晶[22]研究表明，ESR基因影響蘇太豬的產(chǎn)仔數(shù)和初生窩質(zhì)量(P<0.05)。胡閃耀[23]研究表明，ESR基因影響大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩質(zhì)量(P<0.05)。

對(duì)于ESR基因與早期生長(zhǎng)性能的研究并不多，王宵燕等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蘇姜豬的ESR基因的AA基因型體長(zhǎng)顯著高于BB基因型(P<0.05)，且體高、胸圍、體質(zhì)量極顯著高于BB基因型(P<0.01)。劉衛(wèi)東[25]研究表明，ESR基因?qū)M系大白豬和皖系大白豬的日增質(zhì)量有顯著影響(P<0.05)，而對(duì)體高、體長(zhǎng)、胸圍無(wú)顯著影響。李隱俠[26]研究發(fā)現(xiàn)，在蘇淮豬群體中ESR基因的各基因型對(duì)早期生長(zhǎng)性能的影響無(wú)顯著差異(P>0.05)。可見(jiàn)，ESR基因?qū)Σ煌贩N豬早期生長(zhǎng)性能的影響也是不同的。本研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因外顯子1與朝鮮鵪鶉的脛長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)、脛圍有相關(guān)性(P<0.05)，與北京白羽鵪鶉的體質(zhì)量有相關(guān)性(P<0.05)，與中國(guó)黃羽鵪鶉的體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸深、體長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)有相關(guān)性(P<0.05)?？梢?jiàn)，ESR1基因外顯子1在不同鵪鶉品種中對(duì)早期生長(zhǎng)性能的影響也不同。朝鮮鵪鶉、北京白羽鵪鶉和中國(guó)黃羽鵪鶉是蛋用鵪鶉，在選種時(shí)首先考慮其產(chǎn)蛋數(shù)這一繁殖性能外，還要兼顧其體質(zhì)量、體長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)等生長(zhǎng)性能。因此，ESR1基因外顯子1可作為候選基因應(yīng)用于蛋用鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的分子標(biāo)記輔助選擇。