張 嫻，李超林，鄭喬木，嚴(yán)子成，廖 海，周嘉裕

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)屬于絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶的S1家族成員，在動(dòng)物、植物、微生物、病毒中均有發(fā)現(xiàn)，其活性部位常含有Ser-His-Asp組成的催化三聯(lián)體，專一性切割苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的羧基端肽鍵[1-4]。在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、煙草天蛾(Manducasexta)與小菜蛾(Plutellaxylostella)等鱗翅目昆蟲(chóng)中，胰凝乳蛋白酶是中腸的重要蛋白質(zhì)水解酶，能夠水解食物蛋白質(zhì)，為昆蟲(chóng)提供必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]。此外，胰凝乳蛋白酶還參與多種生理過(guò)程，如免疫應(yīng)答[6]、幾丁質(zhì)合成[7]、蛻皮[8]、發(fā)育[9]及蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白的激活[10]等。

菜青蟲(chóng)(Pierisrapae)屬鱗翅目粉蝶科菜粉蝶屬，是菜粉蝶的幼蟲(chóng)，已知的寄主植物有9科35種之多，嗜食十字花科植物，特別偏食厚葉片的甘藍(lán)、花椰菜、白菜、蘿卜等，每年給十字花科蔬菜造成極其嚴(yán)重的損失。目前，預(yù)防和控制菜青蟲(chóng)主要通過(guò)施用化學(xué)農(nóng)藥，但由于菜青蟲(chóng)耐藥性不斷增加，必須頻繁用藥才能防止菜青蟲(chóng)再度猖獗，而頻繁用藥導(dǎo)致的食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題，一直備受爭(zhēng)議和重視[11]。BROADWAY[12]研究發(fā)現(xiàn)，菜青蟲(chóng)主要依賴胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶行使消化功能，由此認(rèn)為胰凝乳蛋白酶可能是抗蟲(chóng)因子作用的重要靶點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)菜青蟲(chóng)中腸絲氨酸蛋白酶研究的報(bào)道較少，僅朱洋鏗[13]從菜青蟲(chóng)蛹期脂肪體和血細(xì)胞中克隆出4個(gè)胰蛋白酶基因，證明其參與菜粉蝶的先天免疫反應(yīng)。

XIANG等[14]前期對(duì)菜青蟲(chóng)中腸開(kāi)展了比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)菜青蟲(chóng)中腸中有多個(gè)胰凝乳蛋白酶候選基因，其中，部分基因的表達(dá)受到了抗蟲(chóng)因子——蛋白酶抑制劑的影響。本研究選取在轉(zhuǎn)錄組3個(gè)樣本間(正常、饑餓、喂食抑制劑)表達(dá)顯著差異的1個(gè)胰凝乳蛋白酶候選基因 (編號(hào):c31814.graph_c0)進(jìn)行克隆、序列分析及原核表達(dá)，并利用qRT-PCR分析其在菜青蟲(chóng)不同組織部位及受到饑餓和決明胰蛋白酶抑制劑(Cassiaobtusifoliatrypsin inhibitor，COTI)脅迫后的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究該基因的功能及篩選抗蟲(chóng)新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲(chóng)源

菜青蟲(chóng)購(gòu)自神農(nóng)生物科技有限公司。將菜青蟲(chóng)置于(25±1)℃、相對(duì)濕度75%、光周期L∶D=14∶10條件下，用新鮮未施用農(nóng)藥的白菜葉片飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RNA提取TRIzol?-Reagent 購(gòu)自Invitrogen公司；DNA 純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、DL2000 DNA Marker、高保真酶PrimesSTAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、pMD19-T克隆載體購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;鎳離子親和層析柱購(gòu)自GE公司；大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta(DE3)、質(zhì)粒pET28a由本實(shí)驗(yàn)室(藥用植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)保存；COTI由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組菌表達(dá)純化所得[15]；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 基因克隆及序列分析

選取菜青蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)，解剖得到中腸，采用傳統(tǒng)Trizol萃取法提取中腸總RNA，每只菜青蟲(chóng)中腸用液氮研磨之后加入1 mL TRIzol?-Reagent。提取的總RNA用酶標(biāo)儀和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性，放入-80 ℃冰箱中備用。按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase說(shuō)明書(shū)方法，以O(shè)ligo(dT)18為引物(表1)合成cDNA，保存于-20 ℃。以菜青蟲(chóng)中腸cDNA為模板，用引物PrCT1F和PrCT1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化后，克隆到pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選菌液陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。

對(duì)PrCT1的分子質(zhì)量(http://web.expasy.org/compute_pi/)、信號(hào)肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能域(http://smart.emblheidelberg.de/)等進(jìn)行在線預(yù)測(cè)；利用MEGA 7軟件對(duì)PrCT1與其同源絲氨酸蛋白酶進(jìn)行多序列比對(duì)，并用ESPript著色[16]，再用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(去除空位，采用1 000次重復(fù)進(jìn)行自舉檢驗(yàn))。

表1 研究所用引物及其用途

注：＿表示限制性酶切位點(diǎn)。

Note：＿indicates restriction enzyme sites.

1.4 原核表達(dá)

根據(jù)克隆的PrCT1基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)引物PrCT1YF和PrCT1YR(表1)。以克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化后，克隆到pET28a載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，菌液以PCR篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將獲得的pET28a-PrCT1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞，用終濃度為 0.5 mmol/L的異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于27 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，用50 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.0)重懸，經(jīng)超聲波破碎和高速離心，分別收集破碎菌體的上清和沉淀，用15% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。將重組菌在不同溫度(19、23、27、30、33、37 ℃)、不同IPTG濃度(0.1、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0 mmol/L)條件下分別進(jìn)行表達(dá)，對(duì)PrCT1表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。表達(dá)條件優(yōu)化后大量誘導(dǎo)重組菌表達(dá)目的蛋白，按照馮文榮[17]的方法，將包涵體洗滌、變性后，經(jīng)Ni2+親和層析純化，用250 mmol/L咪唑洗脫，再經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白質(zhì)。

1.5 PrCT1基因在不同組織中和不同脅迫處理?xiàng)l件下表達(dá)模式分析

不同組織：取4齡菜青蟲(chóng)，將其解剖為頭、尾、脂肪體、中腸4個(gè)組織。

饑餓處理：在正常飼養(yǎng)條件下，對(duì)4齡菜青蟲(chóng)進(jìn)行饑餓處理，分別在饑餓處理4、8、16 h后收集菜青蟲(chóng)中腸。

COTI喂食處理：從菜青蟲(chóng)3齡開(kāi)始喂食含COTI(質(zhì)量濃度0.8 mg/mL)白菜，4齡時(shí)收集菜青蟲(chóng)中腸。

不同處理均以正常喂食4齡菜青蟲(chóng)作為對(duì)照(CK)，每組樣品分別收集6頭幼蟲(chóng)。利用所取材料獲得的cDNA為模板，以UPF3為內(nèi)參基因[18]，使用UPF3與PrCT1熒光定量PCR引物(表1)，按照熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作。反應(yīng)總體系為20 μL，擴(kuò)增程序：94 ℃ 60 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，收集PrCT1基因和UPF3基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的克隆與序列分析

對(duì)菜青蟲(chóng)中腸轉(zhuǎn)錄組中編號(hào)為c31814.graph_c0的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)長(zhǎng)度為861 bp的完整ORF，編碼286個(gè)氨基酸。在ORF的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行T-A克隆，核酸測(cè)序結(jié)果顯示其與c31814.graph_c0相似度為97.10%，表明已成功克隆得到PrCT1基因，其全長(zhǎng)序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列見(jiàn)圖1。利用NCBI的BLAST工具，發(fā)現(xiàn)PrCT1基因編碼的氨基酸序列與菜青蟲(chóng)基因組中預(yù)測(cè)的chymotrypsin-1-like(GenBank登錄號(hào)：XP_022112774.1)完全一致，其基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。與其他鱗翅目昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的同源性為34%～49%，其中，與黑脈金斑蝶(GenBank登錄號(hào)：OWR53227)胰凝乳蛋白酶的同源性最高，達(dá)到49%，親緣關(guān)系最近。PrCT1的1—18位氨基酸殘基為信號(hào)肽，34—274位氨基酸殘基為絲氨酸蛋白酶的特征結(jié)構(gòu)域(Tryp_SPc domain)。去除N-末端信號(hào)肽后，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為29.71 ku，理論等電點(diǎn)為9.23。

——表示活性相關(guān)的保守基序；*表示催化三聯(lián)體位點(diǎn)(H57、D102、S195)—— indicates activity related conservation motif; * indicates conserved catalytic triad(H57,D102,S195)圖1 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶PrCT1基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

PrCT1的氨基酸序列中含有高度保守的催化三聯(lián)體(H57、D102、S195)和成熟體活化位點(diǎn)RIVGG，且活性位點(diǎn)附近序列TAAHC和GDSGSAL，以及3對(duì)二硫鍵的半胱氨酸殘基等相關(guān)活性元件都較為保守(圖2A)[3-4,19-20]。HEDSTROM[3]與PERONA等[21]對(duì)絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋分析、多序列比對(duì)顯示，上述蛋白酶的底物特異性位點(diǎn)均是G189-G216-D226，因此，PrCT1屬于胰凝乳蛋白酶，這與NCBI的BLAST搜索結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析(圖2B)表明，上述蛋白酶主要聚為2支，一支包括了PrCT1和蛺蝶科、螟蛾科、蠶蛾科、尺蛾科物種的絲氨酸蛋白酶，且PrCT1與黑脈金斑蝶在進(jìn)化關(guān)系上較近；另一支由鳳蝶科、天蛾科、菜蛾科、夜蛾科物種的絲氨酸蛋白酶組成。將多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化關(guān)系越接近的物種其氨基酸序列相似性越高。

2.2 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的原核表達(dá)及純化情況

由于大腸桿菌表達(dá)體系無(wú)法切掉信號(hào)肽，因此，在構(gòu)建pET28a-PrCT1重組載體時(shí)去掉了信號(hào)肽。重組載體轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌株，27 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組菌株超聲破碎的沉淀物中有1條分子質(zhì)量為33.26 ku的誘導(dǎo)蛋白條帶(圖3A)，其分子質(zhì)量超過(guò)了PrCT1重組蛋白的分子質(zhì)量。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是在重組蛋白N末端上游加入了His標(biāo)簽，導(dǎo)致表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量偏高。誘導(dǎo)表達(dá)的PrCT1重組蛋白出現(xiàn)在沉淀中，表明其以包涵體形式表達(dá)，還需后期的蛋白質(zhì)復(fù)性。研究了不同溫度及不同IPTG濃度對(duì)PrCT1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)溫度為27 ℃時(shí)，PrCT1的表達(dá)量最高。IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)即有大量重組蛋白表達(dá)。IPTG濃度的增加對(duì)PrCT1表達(dá)量沒(méi)有明顯的影響，因此，誘導(dǎo)溫度為27 ℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L是PrCT1的最佳誘導(dǎo)條件。將重組菌在最佳誘導(dǎo)條件下進(jìn)行大量表達(dá)，收集菌體以超聲波破碎，包涵體經(jīng)洗滌、變性、Ni2+親和層析獲得純化目的蛋白(圖3B)。

黑色長(zhǎng)方塊表示相同的氨基酸；□表示較保守的氨基酸；★表示保守的催化三聯(lián)體位點(diǎn)(H57、D102、S195)；表示成熟體切割位點(diǎn)；▲表示底物特異性位點(diǎn)(189、216、226)；●表示6個(gè)保守的半胱氨酸殘基；─表示活性相關(guān)的保守基序

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組菌誘導(dǎo)前；2：重組菌誘導(dǎo)后；3：重組菌誘導(dǎo)破碎上清液；4：重組菌誘導(dǎo)破碎沉淀；5：重組菌未誘導(dǎo)破碎上清液；6：重組菌未誘導(dǎo)破碎沉淀；7：空載菌誘導(dǎo)破碎上清液；8：空載菌誘導(dǎo)破碎沉淀；9：10 mmol/L咪唑洗脫后的蛋白質(zhì)；10：250 mmol/L咪唑洗脫后的蛋白質(zhì)

M:Protein marker(standard);1:Before recombinant bacteria were induced by IPTG;2:After recombinant bacteria were induced by IPTG;3:Supernatant with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were induced by IPTG;4:Deposit with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were induced by IPTG;5:Supernatant with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were not induced by IPTG;6:Deposit with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were not induced by IPTG;7:Supernatant with ultrasonic disruption after the control bacteria were induced by IPTG;8:Deposit with ultrasonic disruption after the control bacteria were not induced by IPTG;9:Expression product eluted by 10 mmol/L imidazole;10:Expression product eluted by 250 mmol/L imidazole

圖3 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的原核重組表達(dá)(A)及純化(B) 檢測(cè)
Fig.3 Prokaryotic recombinant expression(A) and purification(B) detection of the chymotrypsinPrCT1gene ofPierisrapae

2.3 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶PrCT1基因在不同組織中和不同脅迫處理?xiàng)l件下表達(dá)模式分析

將菜青蟲(chóng)解剖為頭、尾、脂肪體和中腸，利用qRT-PCR檢測(cè)PrCT1mRNA在菜青蟲(chóng)不同組織中表達(dá)情況(圖4A)。結(jié)果顯示，PrCT1基因在其4個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)水平差異顯著，表現(xiàn)出組織特異性。其中，在中腸內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是尾，脂肪體中表達(dá)量最低。昆蟲(chóng)中腸是食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收的主要器官，而絲氨酸蛋白酶家族是鱗翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)消化酶，家族成員主要包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其約占消化酶活性的95%[5]，因此，PrCT1基因可能參與食物消化。

對(duì)菜青蟲(chóng)進(jìn)行饑餓、COTI喂食脅迫處理，利用qRT-PCR檢測(cè)PrCT1mRNA在中腸中的表達(dá)情況(圖4B、C)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜青蟲(chóng)受到饑餓脅迫后，PrCT1的相對(duì)表達(dá)量在饑餓4 h后迅速下降，只有對(duì)照組的0.63%，8 h后表達(dá)水平略有升高，為對(duì)照組的11.90%，16 h后表達(dá)水平持續(xù)下降，僅為對(duì)照組的0.29%，表明PrCT1的表達(dá)情況與中腸食物量密切相關(guān)，推測(cè)其可能是菜青蟲(chóng)中腸內(nèi)發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白質(zhì)。其中，饑餓8 h相對(duì)表達(dá)量略有升高，可能是消化體內(nèi)儲(chǔ)存的物質(zhì)以供饑餓狀態(tài)下生理活動(dòng)需要所致。菜青蟲(chóng)在喂食含有COTI的葉片后，其表達(dá)水平也顯著降低，僅為對(duì)照組的0.24%，表明其表達(dá)受到COTI的負(fù)調(diào)控，而蛋白酶抑制劑被昆蟲(chóng)攝食后，會(huì)抑制腸道內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶活性或負(fù)調(diào)控其表達(dá)水平[5,22]，因此，PrCT1基因可能是重要的抗蟲(chóng)靶點(diǎn)。

圖4 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶基因PrCT1 mRNA在不同組織中(A)和不同脅迫處理?xiàng)l件下(B、C)表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of the chymotrypsin PrCT1 mRNA of Pieris rapae in different tissues(A) and different stress treatment conditions(B and C)

3 結(jié)論與討論

鱗翅目昆蟲(chóng)中腸內(nèi)蛋白質(zhì)的消化主要依靠胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶，占消化酶活性的95%[5]。在鱗翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)，胰凝乳蛋白酶的功能呈現(xiàn)多樣化，各成員的具體功能及在生理活性中的作用仍不清楚，因此，有必要獲取胰凝乳蛋白酶并對(duì)其開(kāi)展功能研究。根據(jù)XIANG等[14]前期獲得的菜青蟲(chóng)中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選出11個(gè)胰凝乳蛋白酶基因和7個(gè)活性位點(diǎn)不完整的胰凝乳蛋白酶基因同源物。小菜蛾[23]與家蠶[24]中也存在多個(gè)胰凝乳蛋白酶活性位點(diǎn)不完整同源物，推測(cè)這些同源物可能參與昆蟲(chóng)對(duì)植物抗蟲(chóng)因子(尤其是植物蛋白酶抑制劑)的適應(yīng)過(guò)程，有利于昆蟲(chóng)對(duì)植源性食物的消化。

經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，c31814.graph_c0所編碼的氨基酸序列具有明顯的絲氨酸蛋白酶的典型特征，即催化三聯(lián)體(H57、D102、S195)，這與已克隆得到的其他鱗翅目昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶氨基酸序列擁有共同的酶活催化中心，但其同源性差異較大。絲氨酸蛋白酶根據(jù)底物口袋中3個(gè)特異性位點(diǎn)(189、216、226)氨基酸殘基的差異，可分為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶等不同類型。第189位的氨基酸殘基位于底物口袋的底部，是決定酶催化底物特異性的最重要氨基酸；而第216位和第226位氨基酸位于酶底物口袋的入口處，限制了底物大小，若被替換為較大的氨基酸，將只有小分子底物能夠進(jìn)入底物口袋[3,21]。PrCT1的第189位氨基酸殘基是甘氨酸，第216位和第226位氨基酸殘基分別是甘氨酸與天門(mén)冬氨酸，側(cè)鏈較小，形成了較大的入口，允許擁有較大側(cè)鏈的芳香族氨基酸進(jìn)入底物口袋，屬于胰凝乳蛋白酶。

將PrCT1導(dǎo)入原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中，通過(guò)不同IPTG濃度、不同溫度誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)27 ℃、0.5 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果最好。融合蛋白的可溶性分析表明，在各種優(yōu)化篩選條件下，PrCT1均為包涵體蛋白，這可能是由于目的蛋白合成速度較快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行加工，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀所致；還可能是由于絲氨酸蛋白酶為真核蛋白質(zhì)，在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的時(shí)候，缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，蛋白質(zhì)內(nèi)部的3對(duì)二硫鍵不能正確配對(duì)[25]所致。

蛋白酶參與消化過(guò)程的一個(gè)重要特點(diǎn)是在食物刺激下，其表達(dá)量會(huì)明顯增加。很多研究通過(guò)饑餓處理試驗(yàn)來(lái)探究中腸絲氨酸蛋白酶與消化之間的關(guān)系，如斜紋夜蛾的類胰凝乳蛋白酶(Sfctlp1和Sfctlp2)均在饑餓后下調(diào)表達(dá)，重新喂食后上調(diào)表達(dá)[26-27]，這表明饑餓處理昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)后，中腸內(nèi)與食物消化相關(guān)的蛋白酶表達(dá)下調(diào)。蛋白酶抑制劑是植物抵抗攝食昆蟲(chóng)的防御物質(zhì)，其能夠抑制昆蟲(chóng)絲氨酸類蛋白酶的活性，影響昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)吸收，從而抑制昆蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育與生理代謝，甚至導(dǎo)致死亡[28]。昆蟲(chóng)在與植物的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中產(chǎn)生了對(duì)植物源蛋白酶抑制劑的適應(yīng)性進(jìn)化，其中一種方式是誘導(dǎo)表達(dá)一些對(duì)蛋白酶抑制劑不敏感的新蛋白酶；另一種方式是提高蛋白酶的表達(dá)水平，以補(bǔ)償?shù)鞍酌敢种苿┮鸬牡鞍酌富钚該p失[5]。由此，TELANG等[22]認(rèn)為蛋白酶抑制劑發(fā)揮抗蟲(chóng)作用的靶點(diǎn)可能是那些敏感的蛋白酶，其能夠與蛋白酶抑制劑結(jié)合，觸發(fā)酶活性下降，亦或其表達(dá)水平會(huì)受到蛋白酶抑制劑的負(fù)調(diào)控。本研究中，PrCT1mRNA主要在菜青蟲(chóng)中腸表達(dá)，且經(jīng)饑餓和喂食決明胰蛋白酶抑制劑COTI后其表達(dá)水平均下調(diào)，表明PrCT1的表達(dá)受中腸食物的誘導(dǎo)，但受COTI的抑制，推測(cè)PrCT1可能是菜青蟲(chóng)中腸中發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白質(zhì)，且可能是蛋白酶抑制劑重要的作用靶點(diǎn)。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)PrCT1開(kāi)展復(fù)性研究，檢測(cè)COTI對(duì)其是否具有抑制作用。