夏金嬋,從人愿,張小莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450008)

植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)在種子休眠與萌發(fā)、植物生長發(fā)育及其對生物與非生物脅迫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。高鹽、干旱等逆境脅迫能夠增加植物體內(nèi)的ABA含量。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ABA含量增加時，ABA與受體PYR(Pyrabactin resistance 1)/PYL(PYR1-like)/RCAR(Regulatory component of ABA receptor)結(jié)合形成復(fù)合物[2-3]，進(jìn)而抑制PP2C(Protein phosphatase 2C)磷酸酶的活性[4]。PP2C是ABA信號通路的一個負(fù)調(diào)控因子，在信號傳遞過程中ABA可以抑制PP2C磷酸酶的活性，從而解除PP2C對SnRK2(Sucrose nonfermenting 1 related protein kinase 2)的抑制作用，使SnRK2表現(xiàn)出其激酶的活性[5]，SnRK2磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子ABF(ABRE-binding factors)/AREB(ABA-response elements)或離子通道KAT1 (K+channel inArabidopsisthaliana1)，誘導(dǎo)ABA應(yīng)答基因表達(dá)，引起氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)植物的抗逆能力等[6]。正常生長條件下，植物細(xì)胞內(nèi)ABA含量低，不能激活下游轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREB等。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是植物體中重要的信號分子之一，大量研究證明，NO參與植物生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、葉與根的生長、細(xì)胞凋亡以及植物的抗逆反應(yīng)[7]，而且，NO在調(diào)控植物生長發(fā)育與抗逆反應(yīng)過程中與植物激素之間有密切聯(lián)系。NO參與ABA合成[8]、乙烯合成[9]。在植物中ABA可以誘導(dǎo)第二信使的產(chǎn)生，如NO、鈣離子、過氧化氫、磷酸肌醇等[10-12]。NO通過亞硝基化OST1(Open stomata)/SnRK2.6負(fù)調(diào)控ABA的信號傳遞過程[13]，在根與保衛(wèi)細(xì)胞中ABA能夠誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生[14-15]。由于植物大部分生長發(fā)育現(xiàn)象都受到植物激素的調(diào)控，因此，通過激素起作用可能是植物內(nèi)源NO的作用機(jī)制之一。截至目前，關(guān)于NO與植物激素ABA之間關(guān)系的分子機(jī)制研究相對較少，基于此，采用正向遺傳學(xué)的方法，以甲基磺酸乙酯(EMS)誘變后的擬南芥突變體庫為材料，外源添加硝普鈉(SNP)為篩選條件，成功獲得根長對NO敏感的突變體rsn1(Root sensitive to NO)，并對該突變體進(jìn)行初步的表型及基因定位分析，為揭示植物的NO信號分子調(diào)控機(jī)制提供遺傳材料。

1 材料和方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型為Columbia(Col-0)生態(tài)型。通過EMS誘變野生型擬南芥種子獲得突變體庫。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)及突變體rsn1的篩選 擬南芥在無菌培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)過程：將擬南芥種子用10%～15%次氯酸鈉溶液處理10～15 min，之后點(diǎn)播于1/2MS培養(yǎng)基上，為了使幼苗生長一致，4 ℃黑暗條件下處理4 d，放置在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照周期為16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度為120～150 μmol/(m2·s)、溫度為(22±2)℃、相對濕度為80%。NO敏感性檢測：在滅菌后的1/2MS培養(yǎng)基中添加0、10、20、30、40、50、60 μmol/L SNP，生長20 d后測量根長，并計(jì)算相對根長(相對根長=處理?xiàng)l件下的根長/正常培養(yǎng)基上生長的根長×100%),得到根長表型對NO敏感的突變體rsn1。

1.2.2 背景純化與遺傳分析 以rsn1突變體為母本，與野生型雜交得到F1，在F1中觀察突變基因的顯隱性，F(xiàn)1自交后產(chǎn)生群體F2。把F2點(diǎn)種在含有50 μmol/L SNP的1/2MS培養(yǎng)基上，生長20 d后，統(tǒng)計(jì)根長的分離比，判斷突變是否是單基因突變。得到純合的單基因隱性突變體后，將其與另一種生態(tài)型擬南芥(Ler)雜交，得到F′1種子，自交得到F′2，從F′2中選取對NO敏感的個體進(jìn)行基因定位。

1.2.3 NO含量分析 內(nèi)源NO含量的測定采用DAF-2DA(4,5-diaminofluorescein diacetate)染色法進(jìn)行。分別取在1/2MS培養(yǎng)基上生長7 d的野生型擬南芥和rsn1突變體幼苗的根，在含有1 mmol/L CaCl2、0.25 mmol/L KCl、5 mmol/L MES-KOH的緩沖液(pH值5.7)中溫浴2 h后，用10 μmol/L DAF-2DA染色15 min，同時將所有材料從染液中取出，在緩沖液中清洗后觀察。用配有CCD的熒光顯微鏡(ZEISS Stemi SV 11)對葉片發(fā)射的熒光進(jìn)行記錄和分析。激發(fā)光波長為495 nm，發(fā)射光波長為515 nm(濾光片)，采集圖像的曝光時間恒定。

1.2.4 生理指標(biāo)測定 氣孔直徑：取正常生長20 d的野生型擬南芥與rsn1突變體的葉片表皮，放入緩沖液(10 mmol/L CaCl2、50 mmol/L KCl、10 mmol/L MES，pH值6.15) 中，放置在培養(yǎng)間2 h，利用顯微鏡(DMRE，Leica，Germany)觀察氣孔大小[16]，添加ABA處理后2 h，測定60個氣孔直徑，重復(fù)3次，求平均值。失水率：分別取野生型擬南芥與rsn1突變體葉片各20片置于培養(yǎng)皿中，放入人工氣候室(22 ℃，相對濕度50%)并于1、2、3、4、5、6、7 h稱質(zhì)量，計(jì)算失水率，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 植物基因組DNA提取 將rsn1突變體和Ler雜交得到的分離群體F′2種子點(diǎn)種在含有50 μmol/L SNP的1/2MS培養(yǎng)基上，生長20 d,將對NO具有明顯敏感表型的突變體移至正常培養(yǎng)基上，生長7 d后單株取材作為圖位克隆的作圖群體。挑選根生長受到抑制的幼苗，即具有突變體表型的個體，作為基因定位的群體，把挑選的幼苗放在1.5 mL離心管中，加600 μL抽提Buffer[0.2 mol/L Tris-HCl(pH值9.0)、0.4 mol/L LiCl、25 mmol/L EDTA、1%SDS]，研磨；4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清；加等體積的氯仿，混勻，4 ℃、14 000 r/min離心5 min,取上層，加等體積的異丙醇，混勻后置-20 ℃ 30 min；4 ℃、14 000 r/min離心10 min，棄上清液。

1.2.6 圖位克隆 圖位克隆(Map-based cloning)參考LUKOWITZ等[17]描述的方法。將提取得到的DNA沉淀，用1 mL 75%乙醇洗1次，風(fēng)干；加適量含RNA酶的ddH2O；電泳檢測DNA質(zhì)量。所用Marker均來自TAIR網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)，根據(jù)表型與標(biāo)記的連鎖關(guān)系分析突變基因的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO敏感突變體rsn1的表型驗(yàn)證

從EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選對NO敏感(以根長為標(biāo)準(zhǔn))的突變體，其中，突變體rsn1在根的伸長方面表現(xiàn)出對NO敏感的表型。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該表型，將突變體分單株收取種子后，點(diǎn)種在含有不同濃度SNP的1/2MS培養(yǎng)基上驗(yàn)證其表型。在正常生長條件下，rsn1突變體的萌發(fā)率與野生型沒有明顯區(qū)別，但根長較野生型擬南芥稍短,約是野生型的2/3。突變體rsn1對NO脅迫表現(xiàn)出敏感表型，在SNP處理下，突變體rsn1根生長受到的抑制程度明顯大于野生型，在50 μmol/L SNP處理下生長20 d后，野生型擬南芥的相對根長為48.7%，而突變體rsn1的相對根長僅為5.3% (圖1A、B)。這些結(jié)果表明，rsn1基因參與了NO調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但對植物的正常生長發(fā)育沒有明顯影響。由于nox1和gsnor1突變體對NO敏感，與體內(nèi)NO含量的升高有關(guān)[18]，為明確突變體rsn1中NO含量的高低，故檢測了突變體rsn1根中的NO含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體rsn1中NO含量與野生型無明顯區(qū)別(圖1C)。

A.野生型擬南芥和突變體rsn1在含有0(左)、50(右)μmol/L SNP的培養(yǎng)基上生長20 d的表型； B.SNP處理?xiàng)l件下野生型擬南芥和突變體rsn1 生長20 d的相對根長； C.根中NO含量分析，用DAF-2DA染色采集熒光圖片，上圖為與下圖對應(yīng)的明場圖像A.Phenotypes of wild-type and rsn1 seedlings grown on half-strength MS media supplemented with 0(left) and 50(right) μmol/L SNP; B.Relative root length of rsn1 mutant and wild-type Arabidopsis thaliana growing for 20 days under different concentration of SNP treatment; C.NO content in roots is reflected by fluorescent images of roots stained with DAF-2DA,and the above image is a bright field image corresponding to the image below圖1 突變體rsn1對NO敏感的表型Fig.1 NO-sensitive phenotype of the mutant rsn1

2.2 突變體rsn1的遺傳分析

為了分析rsn1的遺傳學(xué)特性，將rsn1與野生型(Col-0)進(jìn)行雜交，獲得F1種子。F1幼苗自交后獲得F2種子。檢測F1和F2代對NO的抗性。結(jié)果表明，用50 μmol/L SNP處理F1植株，F(xiàn)1植株的根長與野生型擬南芥無明顯差異，即對SNP不敏感，表明該突變體為隱性突變。進(jìn)一步的遺傳分析證實(shí)，在與野生型雜交的F2群體中發(fā)生了性狀分離，根對NO敏感的植株分離比例為998/2 990，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，符合孟德爾遺傳分離規(guī)律(1∶3，表1)?？梢?，rsn1對NO敏感的表型為單基因突變引起的隱性性狀。

表1 rsn1突變體表型的遺傳分析Tab.1 Genetic analysis of the mutant rsn1 phenotype

2.3 rsn1基因的粗定位

把rsn1與Ler生態(tài)型擬南芥雜交，獲得F′1，F(xiàn)′1自交得到F′2。將F′2種子表面消毒后點(diǎn)種在含有50 μmol/L SNP的1/2MS培養(yǎng)基上生長20 d，將對NO具有明顯敏感表型的突變體移至正常培養(yǎng)基上，生長7 d后單株取材作為進(jìn)行圖位克隆的作圖群體。取F′2中分離得到的rsn1突變體，每50株rsn1突變體的DNA混合為1個庫(Pool)，共混合了2個，以此為模板，以5號染色體上的SSLP分子標(biāo)記為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，每個泳道上都有2條電泳條帶，除nga129外，其他分子標(biāo)記擴(kuò)增出的條帶Col-0(上面的條帶)比Ler(下面的條帶)大。從圖2可知，以nga129為引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶中Col-0的條帶(下面的條帶)比較亮(圖2箭頭所指)，并且相鄰的以ciw9為引物擴(kuò)增出的條帶中Col-0的條帶(上面的條帶)也比較亮，說明突變位點(diǎn)在nga129附近。而且，從5條染色體上選取不同的SSLP分子標(biāo)記進(jìn)行粗定位，提取F′2純合子植株的DNA，通過PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)′2重組率在nga129標(biāo)記附近最低(表2)，因此，rsn1中的突變基因位于5號染色體的nga129標(biāo)記附近。

Pool1和Pool2均為50株突變體DNA的混合物；SSLP分子標(biāo)記：1.nga139，2.nga76，3.PHYC，4.ciw9，5.nga129，6.ciw10Pool1 and Pool2 are both DNA mixture of 50 mutants； SSLP molecular markers:1.nga139，2.nga76，3.PHYC，4.ciw9，5.nga129，6.ciw10圖2 第5號染色體上SSLP引物PCR擴(kuò)增F′2中分離出的rsn1突變體的電泳圖譜 Fig.2 Gel electrophoresis of PCR proclucts amplified by SSLP primer on chromosome 5 in the rsn1 mutant of F′2

表2 rsn1基因粗定位時各種SSLP分子標(biāo)記的重組率 Tab.2 Recombination rate of various SSLP molecular markers in rough location of the rsn1 gene

2.4 rsn1基因參與ABA調(diào)控氣孔運(yùn)動過程

NO是植物體內(nèi)一種重要的信號分子,不僅參與根的形態(tài)建成、種子萌發(fā)等生長發(fā)育過程,以及植物對干旱、鹽度、重金屬等非生物脅迫的響應(yīng)過程，還調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的氣孔運(yùn)動過程[19]。進(jìn)一步測定正常生長20 d的野生型擬南芥和突變體rsn1葉片的氣孔直徑和失水速率，發(fā)現(xiàn)正常條件下突變體rsn1與野生型的氣孔直徑相近，但在10 μmol/L ABA處理下，突變體rsn1的氣孔直徑是野生型的1.9 倍，變化小于野生型，且突變體rsn1的失水率高于野生型擬南芥(圖3)，說明rsn1基因參與ABA調(diào)控氣孔運(yùn)動的過程。

圖3 ABA處理下野生型擬南芥和突變體rsn1的氣孔直徑(A)和失水率(B)Fig.3 Stomatal diameter(A) and water loss rate(B) of wild type and rsn1 mutant Arabidopsis under ABA treatment

3 結(jié)論與討論

信號分子NO能夠調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，增強(qiáng)植物的抗逆能力。研究表明，NO能夠緩解干旱脅迫對植物的影響[20]，外源NO能夠降低小麥的氣孔導(dǎo)度，提高其抗旱能力[21]。氣孔作為控制二氧化碳吸收和蒸騰作用水分散失的通道，是植物與外界進(jìn)行物質(zhì)與能量交換的門戶，NO也參與了氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)過程。ABA能夠誘導(dǎo)第二信使如NO、活性氧、三磷酸肌醇、鈣離子的產(chǎn)生，接著第二信使參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和其他生理過程[22]，其中已證實(shí)NO參與ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在保衛(wèi)細(xì)胞和根尖中ABA誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生[15]。外源施加NO能夠誘導(dǎo)氣孔的關(guān)閉，NO清除劑(c-PTIO)能夠抑制氣孔的關(guān)閉[23]。研究證實(shí)，NO可以通過調(diào)控一個內(nèi)向K+通道和cGMP參與ABA對氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)過程[24-26]。植物激素ABA在植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境過程中也扮演著重要角色，NO含量低的nia1nia2noa1三突變體中氣孔對ABA脅迫不敏感[15]。WANG等[13]、楊鳳博等[27]研究表明，NO通過OST1/SnRK2.6[Open stomata 1/sucrose nonfermenting 1(SNF1)-related protein kinase 2.6]的亞硝基化負(fù)調(diào)控ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程。但由于NO相關(guān)突變體較少，目前對于其調(diào)控的分子機(jī)制了解的還較少，篩選突變體是進(jìn)行分子機(jī)制研究的一種重要方法[28]。

本研究通過正向遺傳學(xué)方法篩選得到1株對NO敏感的擬南芥突變體rsn1，該突變體正常條件下與野生型擬南芥的萌發(fā)率沒有明顯區(qū)別，但在SNP處理下根表現(xiàn)出敏感的表型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體rsn1葉片的氣孔對ABA引起的氣孔關(guān)閉不敏感，而失水率高于野生型，說明rsn1基因可能參與了ABA調(diào)控的氣孔運(yùn)動過程。遺傳學(xué)分析表明，rsn1是單基因隱性突變。該突變體的獲得將為植物中NO調(diào)控ABA的信號途徑研究提供理想的遺傳材料。