沙志聰,其木格,賈增艷,張 燕,生 威,*

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457; 2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院,天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA),是由曲霉屬和青霉屬等某些真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1],其主要的結(jié)構(gòu)類似物有赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D、甲酯化的赭曲霉毒素A、甲酯化或乙酯化的赭曲霉毒素B[2],其中OTA的毒性和危害性僅次于黃曲霉毒素B1[3],對(duì)人類和動(dòng)物威脅最大[4-6],屬2B類致癌物[7]。OTA能夠損傷人類和動(dòng)物的肝腎器官功能,致畸、致癌、致突變,并具有免疫毒性[8-10]。OTA的污染不僅出現(xiàn)在谷物及其制品、豆類及其制品、酒類、堅(jiān)果及籽類和飲料類等物質(zhì)中,還出現(xiàn)在動(dòng)物飼料里面,當(dāng)動(dòng)物攝食OTA污染的飼料后,因代謝困難導(dǎo)致OTA在體內(nèi)蓄積,會(huì)對(duì)動(dòng)物的肝腎、肌肉和血液產(chǎn)生毒害作用[11]。為了有效控制OTA對(duì)人類以及動(dòng)物產(chǎn)生的危害,國(guó)內(nèi)外規(guī)定了OTA的限量標(biāo)準(zhǔn),其中歐盟對(duì)于OTA在谷物、谷物產(chǎn)品中的最大殘留限量分別是5、3 μg/kg,我國(guó)對(duì)于OTA在谷物及其制品中的最大殘留限量為5 μg/kg[12-15]。

目前用于檢測(cè)OTA的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[16-17]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[18-19],另外還有薄層色譜法(TLC)[20-21]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[22-23]和免疫層析測(cè)定法[24-25]等。免疫層析技術(shù)是結(jié)合了抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫技術(shù)和流動(dòng)相中各組分與固定相的結(jié)合能力不同而分離的色譜層析技術(shù)發(fā)展形成的一種快速檢測(cè)方法,其中膠體金是應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記材料[26]。隨著新型納米材料研究的迅速發(fā)展,由Ⅱ-Ⅳ族或由Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒即量子點(diǎn)(Quantum dot,qd),在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[27]。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比,量子點(diǎn)光穩(wěn)定性好、熒光強(qiáng)度大,同時(shí)具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)、發(fā)射光譜窄且對(duì)稱、斯托克斯位移大、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等獨(dú)特的光學(xué)特性[28-29]。量子點(diǎn)具有優(yōu)良的標(biāo)記特性,標(biāo)記抗體等大分子物質(zhì)后不會(huì)改變大分子物質(zhì)的生物活性[30-35]。目前,OTA免疫層析試紙條在市場(chǎng)上以膠體金標(biāo)記免疫層析試紙條為主。本研究依據(jù)羧基功能化量子點(diǎn)的優(yōu)良性能,制備量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的熒光探針,建立用于檢測(cè)谷物中OTA的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條新方法,以期在現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)谷物樣品中OTA的定性半定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、PVC背板 上海金標(biāo)公司;硝酸纖維素膜 美國(guó)Millipore公司;羧基水溶性量子點(diǎn)(ZnCdSe/ZnS,激發(fā)波長(zhǎng)302 nm,發(fā)射波長(zhǎng)585 nm) 武漢珈源公司;OTA多克隆抗體(IgG Ab) 實(shí)驗(yàn)室自制;OTA、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素、T-2毒素、羊抗兔IgG、雞蛋卵白蛋白(OVA)、無水四氫呋喃、1-(-3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 美國(guó)Sigma公司;玉米、大米、大麥、燕麥 天津市某超市。

HM3035型雙維往復(fù)劃膜儀、ZQ2000型微電腦自動(dòng)斬切機(jī) 上海金標(biāo)公司;HHB11型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市三水公司;ZF1-2型紫外分析儀 上海嘉鵬公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 包被抗原(OTA-OVA)的制備 利用活化酯法制備包被抗原[36]。首先稱取1 mg OTA放于棕色玻璃瓶中,加入200 μL無水四氫呋喃使其溶解。稱取0.57 mg NHS、1.89 mg EDC加入到OTA溶液中,待完全溶解后,置于磁力攪拌器上室溫反應(yīng)24 h。然后10000 r/min、5 min離心除去沉淀,取上清液用氮?dú)獯蹈傻没罨?將活化物重新溶解到300 μL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,即為活化酯溶液。稱取5 mg OVA溶于2 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)中,待完全溶解后置于磁力攪拌器上,在冰浴條件下將活化酯溶液緩慢滴加到OVA溶液中。待將活化酯溶液全部加入到OVA溶液后將混合液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱,攪拌反應(yīng)過夜。用磷酸緩沖溶液(PB,pH=7.4)透析72 h,然后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 QD-Ab的制備 采用活化酯法將羧基功能化的水溶性量子點(diǎn)與抗體進(jìn)行偶聯(lián)。選擇QD與Ab的摩爾比為1∶5、1∶10、1∶15進(jìn)行偶聯(lián)優(yōu)化。首先將25 μL QD加入到1.5 mL離心管中,加入6 μL 10 mg/mL的碳化二亞胺(EDC)溶液,再分別加入111、221、332 μL 1.37 mg/mL的OTA抗體,混合均勻。將離心管固定在搖床上,以260 r/min在室溫下避光反應(yīng)3 h。然后將產(chǎn)物溶液在4 ℃、10000 r/min條件下離心3 min,除去量子點(diǎn)的團(tuán)聚物,得到QD和Ab反應(yīng)的初步產(chǎn)物。最后將初步產(chǎn)物用0.5 mL的超濾離心管在4 ℃、8000 r/min離心5 min,濃縮至100 μL,得到QD-Ab偶聯(lián)物,通過在激發(fā)波長(zhǎng)302 nm、發(fā)射波長(zhǎng)585 nm條件下,測(cè)定偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度,根據(jù)熒光強(qiáng)度確定出最佳QD與Ab偶聯(lián)摩爾比,然后置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.3 QD-Ab的質(zhì)量鑒定 通過測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為302 nm時(shí),QD和QD-Ab在450～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射波長(zhǎng),從而確定QD在偶聯(lián)前后熒光特性是否發(fā)生改變;將1.2.2制備得到的3種QD-Ab,分別進(jìn)行試紙條實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,根據(jù)最終的可視化信號(hào),進(jìn)一步驗(yàn)證最佳QD與Ab偶聯(lián)摩爾比。

1.2.4 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條工作條件的優(yōu)化 分別選用QD-Ab的添加量為0.5、1.0、1.5 μL和工作液添加量為1、5、10、15、20 μL的條件進(jìn)行試紙條上樣檢測(cè),根據(jù)試紙條C、T線熒光可視化信號(hào)強(qiáng)度,確定出最佳的QD-Ab和工作液添加量。

1.2.5 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條的組裝檢測(cè)步驟以及檢測(cè)限的確定 將硝酸纖維素膜、吸水墊、結(jié)合墊和樣品墊按照如圖1所示順序,粘貼在PVC背板上組裝試紙條。將包被抗原和羊抗兔IgG分別包被在試紙條C和T線處,在37 ℃條件下干燥5 h,然后用自動(dòng)斬切機(jī)將粘貼好的PVC背板切成3.7 mm寬的試紙條,放置于含有干燥劑的容器中保存。檢測(cè)時(shí),將100 μL含有QD-Ab、工作液的樣品溶液滴加在樣品墊上,10 min后,觀察檢測(cè)結(jié)果并記錄。當(dāng)試紙條的C線和T線都出現(xiàn)時(shí),判斷為陰性結(jié)果;當(dāng)試紙條的C線出現(xiàn)而T線消失時(shí),判斷為陽(yáng)性結(jié)果;當(dāng)試紙條的C線沒有出現(xiàn)時(shí),試紙條檢測(cè)結(jié)果無效,需要重新檢測(cè)再判定檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)試紙條C線出現(xiàn)而T線消失時(shí)對(duì)應(yīng)的待測(cè)物的最小濃度定義為方法檢測(cè)限。用濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加到量子點(diǎn)免疫層析試紙條的樣品墊上,10 min后,依據(jù)C線和T線在紫外燈下的熒光強(qiáng)度確定試紙條的檢測(cè)限。

圖1 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The quantum-dot-labeled immunochromatographic test strip structure diagram

1.2.6 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條的特異性 為了考查量子點(diǎn)免疫層析試紙條的特異性,用優(yōu)化好的量子點(diǎn)免疫層析試紙條分別檢測(cè)赭曲霉毒素A(0.5 μg/L)和五種常見真菌毒素,包括黃曲霉毒素B1(1000 μg/L)、玉米赤霉烯酮(1000 μg/L)、伏馬毒素B1(1000 μg/L)、嘔吐毒素(1000 μg/L)和T-2毒素(1000 μg/L),通過觀察檢測(cè)結(jié)果判斷試紙條的特異性。

1.2.7 谷物樣品處理與量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法的驗(yàn)證 玉米、大米、大麥、燕麥(經(jīng)天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中檢測(cè)為陰性樣品)用粉碎機(jī)粉碎后,分別稱取5 g樣品置于50 mL離心管內(nèi),加入5 mL的70%甲醇,充分震蕩10 min后,在1000 r/min離心10 min,取上清液用PBS(pH=8.0)稀釋10倍,消除樣品基質(zhì)中糖類、色素和蛋白質(zhì)等對(duì)試紙條產(chǎn)生的影響,然后直接用量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測(cè)。為了驗(yàn)證量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法的有效性,本文選用OTA商品化試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。玉米、大米、大麥和燕麥陰性樣品被分別添加濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg的OTA標(biāo)準(zhǔn)品,制備成待檢樣品,然后分別用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法和OTA商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,判定所建立方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

OTA商品化試劑盒根據(jù)試劑盒操作說明,四參數(shù)擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別進(jìn)行添加和未添加OTA的玉米、大米、大麥、燕麥樣品的檢測(cè),每種樣品重復(fù)測(cè)定3次;選取同一谷物樣品,按照所建立的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法進(jìn)行檢測(cè),每種樣品重復(fù)測(cè)定3次,得到定性半定量結(jié)果。將兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,當(dāng)檢測(cè)同一樣品時(shí),根據(jù)兩者結(jié)果是否一致,判斷OTA量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)方法的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 QD-Ab的制備與質(zhì)量鑒定

在QD-Ab制備過程中,QD與Ab之間不同的摩爾比直接影響QD-Ab的熒光強(qiáng)度,由圖2可知,當(dāng)QD:Ab的摩爾比為1∶10時(shí),偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度最高,連接效果最好。

圖2 QD和Ab偶聯(lián)比的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the coupling ratio of QD to antibody

在激發(fā)波長(zhǎng)為302 nm,QD和QD-Ab熒光發(fā)射光譜如圖3所示,結(jié)果顯示QD和QD-Ab兩者具有相同的最大發(fā)射波長(zhǎng),且熒光強(qiáng)度接近,表明QD與Ab偶聯(lián)后仍保持原有的熒光特性。

圖3 QD和QD-Ab的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescent emission spectrum of QD and QD-Ab conjugate

分別選用QD-Ab、QD-OVA、QD和PBS(pH=8.0)與工作液和緩沖溶液混合后,加到試紙條樣品墊上,10 min后觀察結(jié)果。如圖4所示,QD-Ab能夠與試紙條T線處包被抗原特異性結(jié)合,表明QD標(biāo)記Ab成功,且Ab保持原有生物活性。其他三種物質(zhì)不能在試紙條上出現(xiàn)熒光,表明這三種物質(zhì)不能夠與包被抗原結(jié)合,且沒有非特異性吸附。

圖4 質(zhì)量鑒定圖Fig.4 Result of quality identification 注:從左到右依次為QD-Ab、QD-OVA、QD、PBS。

2.2 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條工作條件的確定

為了獲得最佳檢測(cè)結(jié)果,QD-Ab添加量和工作液的添加量被優(yōu)化,結(jié)果見表1。當(dāng)QD-Ab添加量為1 μL,工作液添加量為10 μL,量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條的C、T線熒光強(qiáng)度適中,條帶清晰,梯度明顯。

表1 QD-Ab和工作液添加量的優(yōu)化Table 1 Optimization of dosage of QD-Ab and working buffer

2.3 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條可視化檢測(cè)限的確定

結(jié)果如圖5所示,當(dāng)OTA濃度為0 μg/L時(shí),試紙條的C線和T線上都出現(xiàn)了熒光強(qiáng)度適中的條帶。隨著OTA濃度的增大,試紙條T線的熒光強(qiáng)度逐漸減弱,當(dāng)OTA濃度為0.5 μg/L時(shí),試紙條T線熒光完全消失。因此,在緩沖溶液中,量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)OTA的檢測(cè)限為0.5 μg/L。

圖5 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)限Fig.5 Detection limit of quantum dot-labeled immunochromatographic test strip注:赭曲霉毒素A的濃度從左到右 依次為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L。

2.4 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條特異性的確定

結(jié)果如圖6所示,低濃度的OTA使得試紙條的T線熒光消失,而檢測(cè)其他高濃度的真菌毒素,試紙條T線上熒光條帶仍然清晰可見,說明試紙條不能識(shí)別其他真菌毒素,同時(shí)說明了量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條對(duì)OTA具有很好的特異性。

圖6 量子點(diǎn)免疫層析試紙條特異性Fig.6 The cross-reactivity of OTA quantum dot strip注:從左到右依次為PBS、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、 玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素、T-2毒素。

2.5 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)實(shí)際樣品

結(jié)果如圖7所示,當(dāng)谷物樣品中OTA的添加濃度為5.0 μg/kg時(shí),試紙條T線熒光消失,因此,谷物樣品中OTA的檢測(cè)限為5.0 μg/kg。

圖7 谷物樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The test results of cereal samples注:a:玉米樣品;b:大米樣品;c:大麥樣品;d:燕麥樣品； 濃度從左到右依次為0、0.5、1、2、5 μg/kg。

2.6 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法的驗(yàn)證

分別用本研究建立的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法和OTA商品化試劑盒對(duì)待檢樣品中OTA殘留量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表2所示,說明本文建立的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條方法具有有效性。

表2 加標(biāo)樣品的分析(n=3)Table 2 Analysis of the spiked samples(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化量子點(diǎn)標(biāo)記抗體過程中的QD與Ab的摩爾比,制備了光學(xué)特性優(yōu)良的QD-Ab熒光探針,優(yōu)化了量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條的工作條件,建立了可用于檢測(cè)玉米、大米、大麥、燕麥樣品中OTA的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)方法。當(dāng)QD與Ab的摩爾比為1∶10時(shí),QD-Ab熒光特性最佳;在QD-Ab和工作液添加量分別為1、10 μL時(shí),量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條結(jié)果最佳;量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條的檢測(cè)限為0.5 μg/L,谷物樣品中的檢測(cè)限為5 μg/kg,整個(gè)檢測(cè)過程不超過10 min;該方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、結(jié)果易于判斷,只需要一個(gè)便攜式紫外燈就可以實(shí)現(xiàn)谷物中OTA的定性半定量可視化檢測(cè),可以滿足谷物中OTA殘留量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。