張海全,鐘曉坤,黃勤英,農(nóng)克良

(廣西民族師范學(xué)院 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西崇左 532200)

肝病是影響人類健康的疾病,但其預(yù)防和治療仍存在局限性。對(duì)天然產(chǎn)物的活性成分開展研究以尋求安全有效的保肝功能性食品是食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。熊果酸具有抗菌[1]、抗炎[2-3]、保肝[4-6]等作用,在食品、藥品領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景[7],未來可作為治療和預(yù)防肝病的藥物之一。文獻(xiàn)報(bào)道苦丁茶中熊果酸含量高達(dá)2.78%[8],可作為熊果酸的重要來源。

張明等[9]利用纖維素酶酶解提取苦丁茶中的熊果酸,提取率為1.26%,較傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取法高,表明酶解工藝可替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取法。此外,微波及超聲法[10]、超臨界CO2萃取法[11]、分子印記固相萃取法[12]等亦可從苦丁茶中提取熊果酸?，F(xiàn)有方法仍存在一定缺點(diǎn),如溶劑消耗量大,提取過程復(fù)雜,條件苛刻等,故苦丁茶熊果酸的提取工藝仍需優(yōu)化。酶法提取工藝具有效率高、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),適用于天然產(chǎn)物活性成分的提取,故可考慮酶法對(duì)苦丁茶熊果酸進(jìn)行提取,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化條件,以期找到最優(yōu)工藝。

研究表明,苦丁茶提取物可有效抑制肝損傷[13],但作用機(jī)制尚未明確。苦丁茶熊果酸保肝作用研究鮮有報(bào)道,試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝,并探討熊果酸對(duì)CCl4致小鼠肝損傷的保護(hù)作用,為開發(fā)苦丁茶作為保肝護(hù)肝保健品提供一定的理論依據(jù),為苦丁茶熊果酸保肝藥理作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只昆明種小鼠,4～5周齡,SPF級(jí),雌雄各半,體重18～22 g,來源于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(桂)2014-0001;苦丁茶 湘君大藥房,經(jīng)廣西民族師范學(xué)院農(nóng)克良教授鑒定為冬青科冬青屬大葉冬青苦丁茶的干燥葉,粉碎過80目篩,備用;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 廣州分析測試中心;纖維素酶 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;聯(lián)苯雙酯滴丸 廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

UV-6100S紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;分析天平 奧豪斯儀器有限公司;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;GZX-GF101-1 BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;GMSP-5倒置顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以香草醛乙酸溶液和高氯酸為顯色體系,采用紫外分光光度法于548 nm測定不同濃度熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,建立熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,方程為Y=0.0242X+0.0078(R2=0.9971)。詳細(xì)操作見參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.2 苦丁茶熊果酸的提取及測定 苦丁茶經(jīng)粉碎過80目篩,以適量蒸餾水浸泡2 h,加入一定量纖維素酶在一定溫度、pH下酶解一定時(shí)間。酶解完成后加熱至100 ℃滅酶,減壓抽濾,濾渣100 ℃烘干。苦丁茶濾渣以液料比為17∶1加入83%的乙醇回流提取1 h,抽濾,濾液減壓濃縮,濃縮物于60 ℃下干燥12 h即得粗產(chǎn)品。

熊果酸含量的計(jì)算按下式:

其中:A為提取液的吸光度;V為提取液的體積,mL;N為提取液稀釋的倍數(shù);m為苦丁茶粉末的質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶用量對(duì)熊果酸含量的影響。設(shè)定酶解時(shí)間1.0 h,酶解溫度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5時(shí)對(duì)熊果酸含量的影響。設(shè)定酶解pH5.0,酶解溫度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)對(duì)熊果酸含量的影響。設(shè)定酶解時(shí)間1.0 h,酶解pH5.0,酶用量0.5 g,考察酶解溫度為46、48、50、52、54 ℃時(shí)對(duì)熊果酸含量的影響。設(shè)定酶解時(shí)間1.0 h,酶解溫度50 ℃,酶解pH5.0,考察酶用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g時(shí)對(duì)熊果酸含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道[15-16],以纖維素酶進(jìn)行試驗(yàn),選取酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間為自變量,通過Design-Expert V8.0.6軟件的Box-Behnken功能,采用三因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解苦丁茶熊果酸的提取工藝,設(shè)計(jì)如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 苦丁茶熊果酸供試品的精制 為獲得精制的熊果酸進(jìn)行保肝實(shí)驗(yàn),粗產(chǎn)品按參考文獻(xiàn)[14]的重結(jié)晶方式提純,采用高效液相色譜法[17]分析純度。

1.2.6 苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠的保護(hù)作用 60只昆明小鼠隨機(jī)分成6組,即正常組、模型組,聯(lián)苯雙酯組及熊果酸低、中、高劑量組,每組10只。熊果酸低、中、高劑量組小鼠灌胃給藥劑量分別為15、30、60 mg/kg,聯(lián)苯雙酯組灌胃給藥劑量為200 mg/kg,正常組和模型組小鼠給予等體積蒸餾水。給藥7 d后[18],除正常組腹腔注射橄欖油外,其余各組小鼠腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液20 mL/kg。隨后禁食不禁水16 h,各組小鼠摘除眼球取血,3000 r/min離心10 min,取血清按照試劑盒說明檢測ALT、AST水平。取血后解剖小鼠,取相同部位肝組織,用生理鹽水制備10%的肝組織勻漿,3000 r/min離心10 min,

上清液按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px和MDA的含量;同時(shí)取肝右葉,10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色后,觀察肝組織的病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可以看出酶解pH對(duì)苦丁茶熊果酸的含量影響較大,其隨酶解pH先增大后減小,當(dāng)酶解pH5.0時(shí)纖維素酶酶活力達(dá)到最大值,能夠充分水解苦丁茶纖維,破壞細(xì)胞壁,充分釋放細(xì)胞內(nèi)的熊果酸,故含量達(dá)到最大值。pH過大或過小時(shí)其酶活性大大降低,甚至可能會(huì)引起部分酶失活,從而影響酶與底物的充分結(jié)合,使酶解效果下降,故選取pH5.0為酶解適宜的pH。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor test

由圖1B可知,隨著酶解時(shí)間的增加苦丁茶熊果酸的含量先上升后下降,這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長,苦丁茶細(xì)胞壁及細(xì)胞間層的纖維素阻擋層已被有效破解,活性物質(zhì)大多已從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到溶液中,細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度已達(dá)到了一種動(dòng)態(tài)平衡,酶解時(shí)間適宜時(shí)剛好能將細(xì)胞壁破壞有利于熊果酸的溶出,酶解時(shí)間增多,雜質(zhì)也大量溶出而不利于熊果酸的純化,故適宜的酶解時(shí)間應(yīng)為1.0 h。

由圖1C可知,在酶解溫度46～48 ℃時(shí),苦丁茶熊果酸的含量隨著溫度的升高而增加,48 ℃達(dá)到最大值,之后則變化不大。推測其原因可能是溫度升高,可能會(huì)引起部分酶失活,喪失催化能力,溫度進(jìn)一步提高,則不利于酶活力的發(fā)揮,因而提取效果變差,此外溫度升高,有可能破壞熊果酸的結(jié)構(gòu),故適宜的提取溫度為48 ℃。

由圖1D可知,苦丁茶熊果酸的含量隨酶用量的增大而增大,但是增大的幅度比較小,這是因?yàn)楫?dāng)酶濃度達(dá)到一定值時(shí),與底物結(jié)合達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,再加大酶用量不利于節(jié)約成本。此外可能會(huì)引起酶促反應(yīng)的產(chǎn)物在溶液中積累會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)造成抑制。故酶用量對(duì)苦丁茶熊果酸的含量影響較小,綜合考慮成本情況,選取酶用量為0.5 g。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型及方差分析 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案,以酶解溫度(A)、酶解pH(B)、酶解時(shí)間(C)為變量,以熊果酸含量(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行擬合得到多元二次回歸擬合方程模型為:Y=37.49-0.15A-0.20B-0.33C+0.015AB+2.29AC+0.24BC-2.81A2-6.38B2-4.63C2,試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodolody experiment

由表3可知,模型的F值為65.79,P值<0.0001,失擬項(xiàng)P=0.1005,說明模型具有顯著性,與試驗(yàn)具有較好的擬合性,誤差小。R2=0.9883,說明模型擬合度較好,用于優(yōu)化酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝是可行的。AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01,說明酶解溫度和酶解pH的一次項(xiàng),酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH的二次項(xiàng)對(duì)熊果酸含量具有極顯著影響(P<0.01)。通過比較P值和F值可得出各因素的影響大小為:酶解時(shí)間>酶解pH>酶解溫度。

表3 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of response surface equations of quadratic regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面曲面坡度的平緩與陡峭程度反映因素?cái)?shù)值變化時(shí)對(duì)熊果酸含量的響應(yīng)靈敏程度,響應(yīng)面圖形的坡度越陡,響應(yīng)值敏感;等高線形狀為橢圓形則表示兩因素交互作用顯著,圓形則表示兩因素交互作用不顯著。由圖2～圖4可知,酶解溫度與酶解pH的交互作用影響不顯著;酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用影響顯著;酶解時(shí)間與酶解pH的交互作用影響不顯著。

圖2 酶解溫度與酶解pH對(duì)苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.2 Effects of enzymolysis temperature and pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

圖3 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

圖4 酶解時(shí)間與酶解pH對(duì)苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time and enzymolysis pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

2.2.3 最佳優(yōu)化工藝與驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert V8.0.6軟件分析得到最佳提取工藝為:酶解溫度為47.91 ℃,酶解pH為4.99,酶解時(shí)間為0.98 h,苦丁茶熊果酸含量為(37.50±0.62) mg/g。考慮實(shí)際操作的可行性,將其優(yōu)化為:酶解溫度為48 ℃、酶解pH為5.0、酶解時(shí)間為1.0 h,以優(yōu)化的工藝條件平行三次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),求平均值。得到苦丁茶熊果酸含量為(37.28±0.89) mg/g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.04%,重復(fù)性良好,與模型預(yù)測值(37.50±0.62) mg/g相近,表明響應(yīng)面法酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝條件可行性好,與實(shí)際情況擬合較好。

2.3 苦丁茶熊果酸的純化精制

AB-8大孔吸附樹脂分離純化并采用乙醇重結(jié)晶得到的苦丁茶熊果酸,經(jīng)高效液相色譜分析純度,結(jié)果見圖5。由圖5B可知,經(jīng)精制后的苦丁茶熊果酸雜質(zhì)較少,保留時(shí)間為15.46 min,采用面積歸一化法計(jì)算其純度為93.1%。在16.52 min處為熊果酸的同分異構(gòu)體齊墩果酸,但含量較少。

圖5 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(A)和供試品(B)的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of UA standard(A)and sample(B)

2.4 苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠的保護(hù)作用

2.4.1 苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、GSH-Px和MDA水平的影響 ALT和AST為檢查肝功能的重要指標(biāo),當(dāng)肝細(xì)胞腫脹破裂、受損或壞死時(shí),肝細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST釋放至血清,導(dǎo)致血清中ALT和AST水平升高;脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物為MDA,其可與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合生成加醛復(fù)合物而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,MDA水平可以反映肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度;當(dāng)肝細(xì)胞遭到大量氯仿自由基攻擊時(shí),細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px會(huì)起到清除自由基的作用,SOD和GSH-Px水平的高低反映機(jī)體清除自由基的能力,間接反映肝細(xì)胞受損的程度。由表4可知,與正常組相比,模型組小鼠血清ALT、AST活性以及肝組織中MDA含量顯著升高(P<0.05);肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.05),說明CCl4致小鼠肝損傷模型造模成功。與模型組相比,聯(lián)苯雙酯組、熊果酸各劑量組血清ALT和AST活性顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,聯(lián)苯雙酯組、熊果酸各劑量組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著提高,并顯著降低MDA水平(P<0.05)。

表4 熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、GSH-Px和MDA水平的影響Table 4 Effects of UA on the level of ALT,AST in serum,SOD,MDA and GSH-Px in liver tissue of CCl4-liver-injury

2.4.2 苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝組織病變的影響 從圖6可以看出,正常組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂,結(jié)構(gòu)破損,伴有炎癥細(xì)胞浸潤,可見壞死斑點(diǎn)。聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞大小較一致,結(jié)構(gòu)較完整,部分細(xì)胞腫脹并有少許胞漿疏松和炎癥細(xì)胞浸潤,說明聯(lián)苯雙酯對(duì)損傷肝細(xì)胞具有較好的治療作用。熊果酸低劑量組小鼠肝細(xì)胞排列有些紊亂,部分腫脹。熊果酸中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤及壞死情況減少。病理學(xué)觀察表明苦丁茶熊果酸能夠減輕CCl4致肝損傷小鼠肝細(xì)胞受損程度。

圖6 苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝組織病變的影響(HE,100×)Fig.6 Effect of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng on liver pathology in induced by CCl4 liver-injuryed mice(HE,100×)

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取苦丁茶中熊果酸的工藝,得到最優(yōu)條件為:酶解溫度為48 ℃,酶解pH為5.0,酶解時(shí)間為1.0 h,該條件下熊果酸含量為(37.28±0.89) mg/g,與模型預(yù)測值(37.50±0.62) mg/g相近,與實(shí)際情況擬合較好。綜合實(shí)驗(yàn)小鼠血清和肝臟中多項(xiàng)生化指標(biāo)以及肝組織病理形態(tài)觀察結(jié)果,苦丁茶熊果酸對(duì)CCl4致小鼠肝損傷具有明顯保護(hù)作用,可為開發(fā)苦丁茶作為保肝功能性食品提供可靠的理論依據(jù)。本文闡明了熊果酸是苦丁茶保肝作用的活性成分之一,但作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究,這也是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。