劉 鑫,鄧 姣,李潔欣,周 軍,李湘洲,2,*

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410004; 2.南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410004)

白藜蘆醇作為一種具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病和抗腫瘤等多種功能的天然營(yíng)養(yǎng)因子,其生理活性方面的研究已較深入,而在功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面仍較少[1]。然而,白藜蘆醇存在水溶性差、性質(zhì)不穩(wěn)定等天然缺陷,人體直接食用后難以被吸收利用,因此,最大限度地提高白藜蘆醇的生物利用度已成為其功能食品、保健品開(kāi)發(fā)的難題[2-3]。

選擇性能優(yōu)良的材料是產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。天然的高分子材料種類繁多,包括多肽、多糖、蛋白等[4-6]。紫膠又名蟲(chóng)膠,是一種紫膠蟲(chóng)寄生于樹(shù)枝上吸食樹(shù)汁后分泌的一種紫紅色天然樹(shù)脂。由于紫膠樹(shù)脂本身具有良好的成膜性且天然無(wú)毒、可食用,在食品,醫(yī)藥領(lǐng)域中被作為一種理想的材料而用作被膜劑和包衣材料,以實(shí)現(xiàn)食品的保鮮和藥物緩釋及靶向給藥功能[7-8]。但紫膠樹(shù)脂較差的水溶性以及結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定使其在利用上受到了極大的限制[9]。

本研究主要采用碳酸鈉對(duì)紫膠樹(shù)脂中的羧基進(jìn)行化學(xué)改性,并將制得的紫膠樹(shù)脂鈉鹽應(yīng)用于白藜蘆醇的包埋,響應(yīng)面法優(yōu)化微膠囊的制備工藝,并對(duì)制備的微膠囊的性能進(jìn)行表征,以獲得具有穩(wěn)定的熱力學(xué)性能和pH響應(yīng)性的白藜蘆醇功能產(chǎn)品,提高人體對(duì)白藜蘆醇的吸收與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

98%的白藜蘆醇 花垣恒遠(yuǎn)植化有限公司;紫膠樹(shù)脂 產(chǎn)于廣西;吐溫80、乙醇、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 優(yōu)級(jí)純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

AUY120分析天平 最小分度0.0001 g,日本島津公司;HH-S1型恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;DF-1集熱式恒溫磁力攪拌器 常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠;KM-700VDV-3超聲波清洗器 昆山美美超聲儀器有限公司;SCIENTZ-18N冷凍干燥儀 寧波新芝;RC-3溶出度測(cè)試儀 天津市光學(xué)儀器廠;B-290噴霧干燥儀 步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易有限公司;ALPHA傅立葉紅外光譜分析儀 BRUKER公司;TU1901紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DSC-8500差示掃描量熱儀和TGA-8000熱重分析儀 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制溶液濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8和6.0 mg/L的白藜蘆醇-乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,以乙酸乙酯為參比,在波長(zhǎng)305 nm處分別測(cè)定各濃度溶液的吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=127.53x+0.0035,R2=0.9994(Res濃度為1.2～6.0 mg/L)。同理得到Res在pH=1.0條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=133.04x-0.0146,R2=0.9994(Res濃度為8.0～160 mg/L);pH=6.8條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=100.18x-0.0024,R2=0.9999(Res濃度為8.0～160 mg/L)。

1.2.2 紫膠樹(shù)脂鈉鹽的制備 配制濃度為0.1 mol/L的碳酸鈉溶液,在60 ℃下,取200 mL碳酸鈉溶液溶解12～14 g的紫膠樹(shù)脂,制備成SSC的飽和溶液,分裝于表面皿中,冷凍干燥后得到SSC,研磨后備用[10]。

1.2.3 SSC/Res微膠囊的制備 稱取一定量的紫膠樹(shù)脂鈉鹽(壁材),溶于水,加入既定的Res(芯材)及乳化劑Tween 80,50 ℃恒溫水浴下磁力攪拌1 h,得到初乳液[11-12],在設(shè)定的進(jìn)料流量和進(jìn)口溫度下,對(duì)初乳液進(jìn)行噴霧干燥,收集微膠囊產(chǎn)品,測(cè)定其Res的包埋率和載藥量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.3中所述方法,以微膠囊中Res包埋率及載藥量為指標(biāo),單因素考察壁材(SSC)與芯材(Res)比、噴霧干燥進(jìn)口溫度、進(jìn)料流量對(duì)微膠囊中Res的包埋效果。其中考察壁-芯比分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1和7∶1 (g/g)時(shí),其它條件為Res和吐溫80加入量均為0.5 g、進(jìn)口溫度140 ℃、進(jìn)料流量10 mL/min;考察進(jìn)口溫度分別為140、150、160、170 ℃時(shí),其它條件為壁-芯比4∶1 (g/g)、吐溫80加入量為0.5 g、進(jìn)料流量10 mL/min;考察進(jìn)料速量分別為8、10、12、14 mL/min時(shí),其它條件為壁-芯比4∶1 (g/g)、吐溫80加入量0.5 g、進(jìn)口溫度140 ℃。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以微膠囊中Res的載藥量為指標(biāo),選擇壁-芯比、進(jìn)口溫度和進(jìn)料流量為考察因素,設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素水平編碼表Table 1 Factors and levelsTable of response surface design

1.2.6 SSC/Res微膠囊中Res包埋率、載藥量的測(cè)定 取50 mg微膠囊產(chǎn)品于離心管中,加入5 mL乙酸乙酯,清洗并溶解微膠囊表面的白藜蘆醇,高速離心后取上清液1 mL于50 mL的容量瓶中,用乙酸乙酯定容,紫外光譜305 nm處測(cè)定其吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到微膠囊表面白藜蘆醇含量。Res包埋率和載藥量的計(jì)算按式1和式2進(jìn)行[13]。

式(1)

式(2)

其中:m0為微膠囊中Res的理論投料量;m1為微膠囊表面的Res含量;m為微膠囊用量。

1.2.7 掃描電鏡(SEM)分析 取適量粉末狀的白藜蘆醇、紫膠樹(shù)脂鈉鹽以及SSC/Res微膠囊粘在有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上,在真空鍍膜機(jī)中噴金,然后用掃描電鏡不同觀察樣品的表觀形貌。

1.2.8 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析 取少量的Res、紫膠樹(shù)脂、SSC以及SSC/Res微膠囊進(jìn)行紅外光譜掃描,分別與干燥的KBr進(jìn)行混合,研磨、壓片。在紅外光譜下掃描,掃描頻率64 Hz,掃描32次,掃描范圍400～4000 cm-1。

1.2.9 熱重-差式掃描量熱(TG-DSC)分析 分別取少量的RES、SSC以及SSC/Res微膠囊至鋁制小坩堝中,封壓后放入DSC測(cè)量?jī)x中。測(cè)量的溫度范圍在30～400 ℃,升溫速率為10 ℃/min。使用液氮為降溫物質(zhì),加熱過(guò)程中均以高純N2為吹掃氣和保護(hù)氣。

分別取經(jīng)預(yù)處理后的RES、SSC以及SSC/Res微膠囊,進(jìn)一步粉碎、篩分,選取粒徑小于120目的樣品進(jìn)行熱重分析,載體為氮?dú)?50 mL/min),升溫速度為10 ℃/min,溫度起始范圍為30～800 ℃。

1.2.10 體外釋放效果測(cè)試 采用透析法考察SSC/Res微膠囊的體外釋放行為。分別以pH為1.0和pH為6.8的PBS溶液作為釋放介質(zhì),考察SSC/Res的釋放性能。稱取50 mg白藜蘆醇粉末及含等量Res的SSC/Res微膠囊固體置于截留分子量為14000 Da的透析袋內(nèi),并將透析袋置于400 mL 的PBS釋放介質(zhì)中。在溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的溶出度儀中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn),一定時(shí)間后取樣5 mL,同時(shí)向其中補(bǔ)加5 mL新鮮的PBS釋放介質(zhì)。樣液用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度,計(jì)算Res的累積釋放率[14-15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 壁-芯比對(duì)SSC/Res微膠囊中Res包埋效果的影響 由圖1可知,隨著壁-芯比的增大,微膠囊中Res的包埋率呈增大的趨勢(shì),這是因?yàn)镾SC壁材量的增加,對(duì)芯材的包埋能力增大,但當(dāng)壁材量增大到一定量后,芯材的包埋率增加不明顯;而隨著SSC用量的增加,Res載藥量呈快速降低的趨勢(shì),這是因?yàn)楸诓牡脑龃?溶液中的固形物總量增大,而Res的加入量不變,導(dǎo)致Res所占比例降低,微膠囊中Res的載藥量降低。綜合微膠囊中Res的包埋率和載藥量,宜選擇壁-芯比為3∶1～5∶1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 壁-芯比對(duì)微膠囊中Res包埋率(a)和載藥量(b)的影響Fig.1 Effects of different wall-core ratios on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.1.2 進(jìn)口溫度對(duì)SSC/Res微膠囊中Res包埋效果的影響 由圖2可知,隨著噴霧干燥進(jìn)口溫度的升高,微膠囊中Res的包埋率和載藥量在140～150 ℃時(shí)較高,這主要是由于溫度較高時(shí)微膠囊的壁材水分迅速揮發(fā),形成固體外殼,防止了芯材的流出,但是當(dāng)進(jìn)口溫度大于160 ℃時(shí),Res的包埋率和載藥量均明顯降低,可能是由于高溫下的水分蒸發(fā)速度更快,在微膠囊的壁表面產(chǎn)生氣孔,降低了壁材的成膜性,導(dǎo)致包埋率和載藥量均下降。而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,進(jìn)口溫度低于140 ℃時(shí),噴霧干燥無(wú)法獲得微膠囊。因此,宜選擇進(jìn)口溫度為140～160 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 不同進(jìn)口溫度對(duì)微膠囊中Res包埋率(a)和載藥量(b)的影響Fig.2 Effect of different inlet temperatures on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.1.3 進(jìn)料流量對(duì)SSC/Res微膠囊中Res包埋效果的影響 由圖3中可知,微膠囊中Res的包埋率和載藥量均隨著進(jìn)料流量的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)噴霧干燥進(jìn)料流量較低時(shí),料液中的水分易于蒸發(fā)而形成干粉狀的微膠囊顆粒;而當(dāng)進(jìn)料流量過(guò)大時(shí),料液中較多的水分無(wú)法完全蒸發(fā),導(dǎo)致微膠囊中水份含量較高,同時(shí)影響微膠囊的包埋效果。當(dāng)進(jìn)料流速為10 mL/min時(shí),制備的微膠囊中Res的包埋率和載藥量均為最大值。因此,宜選擇進(jìn)料流速為8～12 mL/min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 不同進(jìn)料流量對(duì)微膠囊中Res包埋率(a)和載藥量(b)的影響Fig.3 Effect of different feed rates on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。以載藥量為響應(yīng)值。以壁-芯比(A)、進(jìn)口溫度(B)、流量(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共包括17個(gè)實(shí)驗(yàn)方案。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及載藥量Table 2 Response surface test and its results

2.2.2 回歸擬合方程及方差分析 由表3可知,“Prob>F”值小于0.050表明模型的影響顯著。對(duì)于失擬項(xiàng)擬合方程的顯著性較好,擬合度R2=0.9904。通過(guò)軟件進(jìn)行二次回歸響應(yīng)分析,建立多元二次響應(yīng)面回歸模型,得到回歸方程為:Y=15.73-2.21A+0.12B-8.750E-003C-0.31AB+0.17AC-0.26BC-0.48A2+0.61 B2-0.79C2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的優(yōu)化工藝為壁-芯比3∶1 (g/g)、進(jìn)口溫度160 ℃、進(jìn)料流量9.45 mL/min,此條件下模型預(yù)測(cè)的微膠囊中Res最大載藥量為18.56%。在3∶1、進(jìn)口溫度160 ℃、進(jìn)料流量為9.5 mL/min條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為18.17%,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果較為接近,說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法預(yù)測(cè)制備微膠囊的工藝可靠[16]。

2.3 優(yōu)化工藝下制備的SSC/Res微膠囊的性能分析

2.3.1 掃描電鏡分析 由圖4可知,白藜蘆醇外形細(xì)長(zhǎng),大小不均勻,晶體結(jié)構(gòu)較大可達(dá)100 μm;利用碳酸鈉對(duì)紫膠樹(shù)脂改性后得到的SSC為不規(guī)則的小顆粒,粒徑較大;而經(jīng)噴霧干燥制備的SSC/Res微膠囊為球體結(jié)構(gòu),表面光滑且無(wú)明顯裂縫,囊壁的結(jié)構(gòu)保持完整,粒徑分布在1～8 μm,與Res和SSC相比,微膠囊的粒徑明顯減小。噴霧干燥技術(shù)能制備形態(tài)較好、穩(wěn)定性好的SSC/Res微膠囊。

圖4 樣品的SEM圖Fig.4 SEM analysis 注:a:白藜蘆醇(500×);b:紫膠樹(shù)脂鈉鹽(500×); c:SSC/Res微膠囊(5000×)。

2.3.2 紅外光譜分析 由圖5對(duì)比紫膠樹(shù)脂和紫膠樹(shù)脂鈉鹽的紅外光譜圖可知,紫膠樹(shù)脂鈉鹽和紫膠樹(shù)脂的紅外特征吸收峰基本吻合,但改性后紫膠樹(shù)脂鈉鹽在1713、1253、1042 cm-1及指紋圖譜區(qū)的紅外吸收明顯減弱,而1565 cm-1處的吸收峰明顯增強(qiáng),這是由于羧酸成鹽后形成的羧酸根負(fù)離子兩個(gè)相同的C-O鍵發(fā)生振動(dòng)耦合效應(yīng)[17],說(shuō)明碳酸鈉對(duì)紫膠樹(shù)脂的改性成功。Res紅外光譜圖中3220 cm-1附近為酚羥基特征吸收峰,1608、1588和1513 cm-1附近為苯環(huán)特征吸收峰[18],以紫膠樹(shù)脂鈉鹽為壁材制成的SSC/Res微膠囊紅外譜圖中保留了部分紫膠樹(shù)脂鈉鹽本身的特征吸收峰,在1513和3200 cm-1處出現(xiàn)了白藜蘆醇的特征吸收峰,由于Res與紫膠樹(shù)脂鈉鹽部分特征吸收峰相同,且紫膠樹(shù)脂鈉鹽作為壁材對(duì)Res包埋后,Res的特征吸收峰大部分被掩蔽,所以制備的SSC/Res微膠囊Res特征吸收峰不太明顯。

圖5 紅外光譜掃描對(duì)比圖Fig.5 Contrast figure of FT-IR analysis注:a:Res;b:SSC/Res微膠囊;c:SSC;d:紫膠樹(shù)脂。

2.3.3 TG-DSC分析 由圖6可知,3組樣品的熱解過(guò)程大致可以分為3個(gè)階段,包括干燥階段、主失重階段以及炭化階段[19]。紫膠樹(shù)脂鈉鹽在第一階段的失重速率明顯快于SSC/Res微膠囊和Res樣品,在290 ℃之前,SSC/Res微膠囊和Res樣品的熱解速率基本一致,而290 ℃之后,Res樣品熱解進(jìn)入主失重階段,熱解失重速率快速增加;SSC/Res微膠囊在350 ℃之后才進(jìn)入主失重階段,說(shuō)明SSC/Res微膠囊的熱穩(wěn)定性優(yōu)于白藜蘆醇和紫膠樹(shù)脂鈉鹽。

圖6 熱重分析對(duì)比圖Fig.6 Contrast figure TG analysis注:a:SSC/Res微膠囊;b:紫膠樹(shù)脂鈉鹽;c:Res。

當(dāng)Res被紫膠樹(shù)脂鈉鹽包埋后得到的SSC/Res微膠囊產(chǎn)品的熱力學(xué)性質(zhì)可能會(huì)發(fā)生一定的變化,為了進(jìn)一步驗(yàn)證微膠囊的熱穩(wěn)定性,采用DSC對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行熱力學(xué)分析。由圖7可知,Res樣品在270 ℃附近出現(xiàn)一個(gè)尖銳的吸熱峰,對(duì)應(yīng)為Res的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。而SSC/Res微膠囊在此處沒(méi)有出現(xiàn)明顯的吸熱峰,由此證明改性后的微膠囊提高了白藜蘆醇的熱穩(wěn)定性。

圖7 DSC對(duì)比圖Fig.7 Contrast figure of DSC analysis注:a:Res;b:SSC/Res微膠囊;c:紫膠樹(shù)脂鈉鹽。

2.3.4 SSC/Res微膠囊體外釋放性能 食物經(jīng)人體攝入后一般需要經(jīng)過(guò)口腔、胃及小腸吸收后進(jìn)入人體的血液循環(huán)中,整個(gè)過(guò)程大約需要 3～16 h,而口腔一般對(duì)淀粉類具有消化功能,而對(duì)淀粉類含量低的食品可忽略不計(jì)[20]。對(duì)于理想的功能食品,應(yīng)具有能夠在胃部強(qiáng)酸性條件下(pH=1.0～2.5)保持穩(wěn)定,而進(jìn)入腸道(pH=5.1～7.8)后能在較短時(shí)間內(nèi)(8～10 h)充分釋放出功能因子,以避免功能因子的提前釋放,同時(shí)有助于其在腸道內(nèi)的吸收。由圖8可知,在pH為1的模擬胃液條件下,4 h內(nèi),SSC/Res微膠囊中Res的釋放速率明顯小于Res樣品;在pH為6.8的模擬腸液中,SSC/Res微膠囊中Res出現(xiàn)突釋,至10 h后釋放速率變緩,而Res樣品10 h后基本釋放完全。在模擬胃液中,Res的累積釋放率為38%,而SSC/Res微膠囊中Res的累積釋放速率僅為18%;在模擬腸液中,4～20 h內(nèi)Res的累積釋放率為45%,而SSC/Res微膠囊中Res的累積釋放速率為60%,說(shuō)明制備的SSC/Res微膠囊具有較好的pH響應(yīng)性,能在模擬腸液中實(shí)現(xiàn)快速釋放。

圖8 體外釋放效果Fig.8 In vitro release注:a:Res;b:SSC/Res微膠囊。

3 結(jié)論

以碳酸鈉改性的紫膠樹(shù)脂鈉鹽為壁材,利用響應(yīng)面法優(yōu)化了噴霧干燥制備SSC/Res微膠囊的工藝。獲得優(yōu)化工藝為壁-芯比3∶1 (g/g),進(jìn)口溫度160 ℃,進(jìn)料流量9.5 mL/min,此條件下Res的載藥量為18.17%,與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值接近,響應(yīng)面法預(yù)測(cè)SSC/Res微膠囊的噴霧干燥制備工藝可靠。

SSC/Res微膠囊的利用SEM、FT-IR和TG-DSC分析表明:紫膠樹(shù)脂鈉鹽對(duì)Res進(jìn)行了有效的包埋,制備的微膠囊為光滑的球體結(jié)構(gòu),熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。SSC/Res微膠囊在模擬胃液環(huán)境下(pH=1)較穩(wěn)定,Res釋放量較少,而在模擬腸液環(huán)境下(pH=6.8)能實(shí)現(xiàn)快速釋放。白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理活性,將其開(kāi)發(fā)成具有腸溶特性的功能食品或保健品,有利于白藜蘆醇在人體腸道內(nèi)的吸收與利用。