孫 薈,蘭海靜,梁曉琳,黃聯(lián)莉,韋子龍,李全陽,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004; 2.廣西普生三鳳乳業(yè)有限公司,廣西南寧 530226)

益生菌在全球范圍內(nèi)已被人們廣泛接受,許多研究結(jié)果顯示,益生菌制品具有多種生理活性功能,如改善和維持正常的免疫系統(tǒng)[1]、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、增強粘膜屏障功能[2]及通過排斥腸道病原菌對腸上皮細胞的黏附從而減輕致病菌引發(fā)的感染等[3]。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是人類腸胃道中的固有菌,我國于2003年[4]將羅伊氏乳桿菌批準為可用于保健食品的益生菌菌種。Chau等[5]的研究表明,羅伊氏乳桿菌DMS 17938對嬰兒腸絞痛有明顯的改善作用;Savino等[6]在嬰兒的飲食中加入羅伊氏乳桿菌DMS 17938后,能夠通過減少病原體定植改善腸道健康。舒中玉等[7]通過灌胃小鼠菌液和上清液發(fā)現(xiàn),羅伊氏乳桿菌L0能夠顯著提高小鼠血液中IL-2和IFN-γ的含量,增強免疫力。但對于羅伊氏乳桿菌遺傳過程中的益生特性并未見報道。

廣西巴馬是中國著名的長壽之鄉(xiāng),郭飛翔[8]和王芳等[9]對巴馬長壽老人腸道菌群進行研究,結(jié)果顯示巴馬長壽老人腸道益生菌的豐度顯著高于其他地區(qū)老人,甚至親緣性與青年人群接近;喻婷等[10-11]從巴馬長壽老人的糞便中篩選出益生特性良好的菌種,但未對其遺傳益生特性進行研究。本研究將從百歲老人體內(nèi)篩選出的羅伊氏乳桿菌與廣西特色“奶中之王[12]”的水牛奶結(jié)合,探索該菌株在培養(yǎng)至300代過程中益生特性的穩(wěn)定性,進一步利用其制備益生菌發(fā)酵水牛奶,以期為拓展該菌株在新型食品中的應用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳桿菌LT018 由實驗室自行篩選,-80 ℃保存;水牛奶 南寧市雄牛牧業(yè)有限公司;脫脂高蛋白奶粉 伊利食品有限責任公司;優(yōu)質(zhì)白砂糖 廣西東亞糖業(yè)有限公司;保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合冷凍干菌粉 丹麥DANISCO公司;蛋白糖 南昌市義和食品有限公司;MRS培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(pepsin 1∶3000) Amresco公司;胰蛋白酶(Trypsin 1∶250) Amresco公司;牛膽汁(oxgall) Sigma公司。

HSS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;DNP-9082BS電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ超凈工作臺 蘇凈安泰;DSX-280B高溫高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;JRJ300-D-I剪切乳化攪拌機 上海標本模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化 羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)TPY固體培養(yǎng)基連續(xù)活化傳代兩次,挑單菌落至液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株的連續(xù)培養(yǎng) 由前期實驗[13]得出的生長曲線可知,羅伊氏乳桿菌LT018在12 h時處于生長對數(shù)期,因此選定12 h為一個培養(yǎng)周期。根據(jù)繁殖代數(shù)計算公式[14]得出,每經(jīng)過12 h繁殖代數(shù)約為5.8代。連續(xù)傳至300代。每隔50代取對數(shù)期菌種進行活菌數(shù)測定、菌活力測定、對人工胃腸液耐受能力的測定和凝集性測定。

繁殖代數(shù)(代)=3.332(lgx2-lgx1)

式中:x1表示0 h時菌株的活菌數(shù),x2表示12 h時菌株的活菌數(shù)。

1.2.3 益生特性相關(guān)指標的測定

1.2.3.1 活菌數(shù)測定 吸取1 mL對數(shù)期的活菌液,沿壁加入到含有9 mL的無菌生理鹽水中,充分振蕩搖勻。連續(xù)稀釋至合適的濃度,取100 μL稀釋菌液進行涂布,37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,計數(shù)。

1.2.3.2 菌活力測定 連續(xù)培養(yǎng),每傳代至50、100、150、200、250代和300代對數(shù)期時,收集各時期的菌液30 mL,4000 r/min 10 min離心收集菌體,加入10 mL的滅菌脫脂乳,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,量取10 mL樣品置于250 mL錐形瓶中,加入20 mL蒸餾水,滴入兩滴酚酞指示劑,以0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定,記錄消耗的NaOH的量,參考國家標準乳和乳制品酸度檢測,根據(jù)公式[15]計算。

式中:C表示NaOH溶液濃度(mol/mL);V表示滴定NaOH標準溶液所消耗的量(mL);m表示試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 對人工胃、腸液耐受能力的檢測 參照朱振軍[11]模擬胃液和模擬腸液的配方,每傳至50、100、150、200、250、300代對數(shù)期,移液槍吸取1 mL菌液加入到模擬胃液中,37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h,適當稀釋后進行涂布計數(shù)。同時吸取1 mL菌液胃液混合液加入到模擬腸液中進行37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,稀釋到合適的濃度進行涂布計數(shù),同時根據(jù)公式計算活菌存活率,以活菌存活率作為胃腸液耐受能力的評判標準。

式中:N0-0 h活菌數(shù);N1-經(jīng)模擬胃液消化3 h后的活菌數(shù);N2-經(jīng)模擬腸液消化24 h后的活菌數(shù)。

1.2.3.4 菌株的凝集性檢測 連續(xù)培養(yǎng),每傳至50、100、150、200、250代和300代對數(shù)期時,取10 mL菌液置于無菌離心管中4000 r/min離心20 min以收集菌體,使用無菌PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮,再用無菌PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)使其OD600值達到0.8,取5 mL重懸液,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 h,取上懸浮液(不搖晃)測定其在600 nm處吸光度,并根據(jù)公式計算自凝集率A(%)。

式中:Ai-原始懸浮液OD值;Af-2 h后上懸浮液OD值。

1.2.4 羅伊氏乳桿菌發(fā)酵水牛乳工藝流程

發(fā)酵劑的制備:將培養(yǎng)至對數(shù)期的羅伊氏乳桿菌LT018液體培養(yǎng)基4000 r/min離心10 min收集菌體,以1%的接種量加入到滅菌的水牛奶中,41 ℃培養(yǎng)直至凝固,備用。按照說明書的比例:1.5 g菌粉發(fā)酵100 kg水牛奶,取適量菌粉加入水牛奶中,37 ℃培養(yǎng)至凝固,配制保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑。

預熱、均質(zhì):在新鮮水牛乳中加入蛋白糖(添加量為每1 kg牛奶中加入0.8 g蛋白糖),按照實驗設計添加白砂糖,在45 ℃下預熱后,進行均質(zhì)。

殺菌、接種:采用巴氏殺菌法對牛乳進行殺菌處理,條件為:95 ℃殺菌5 min。冷卻至40～42 ℃后,按照實驗設計發(fā)酵劑比例進行接種。

發(fā)酵、后熟:在不同的溫度下進行發(fā)酵,發(fā)酵至80 °T后停止,在4 ℃下后熟24 h。

1.2.5 單因素實驗 控制溫度在39 ℃,白砂糖添加量為3%,改變菌種比例(羅伊氏乳桿菌發(fā)酵劑:普通發(fā)酵劑為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)對發(fā)酵乳的影響;控制菌種比例為2∶1,溫度在39 ℃,改變白砂糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對發(fā)酵乳的影響;控制白砂糖添加量為3%,菌種比例為2∶1,改變溫度(37、38、39、40、41 ℃)。通過單因素實驗考察各因素對發(fā)酵乳乳酸菌活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響,初步篩選出各因素中相對適合添加范圍。

1.2.6 響應面優(yōu)化實驗 由單因素實驗確定白砂糖添加量、溫度、發(fā)酵劑菌種比例對感官評定有顯著的影響,因此選定這三種因素為影響因素,以發(fā)酵乳感官評定作為響應值,使用Design軟件設計了中心組合實驗(CCD實驗),如表1所示。利用Box-Behnken響應面分析法確定產(chǎn)品的最佳工藝參數(shù)。

表1 CCD試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of CCD experiment

1.2.7 發(fā)酵乳品質(zhì)指標的測定

1.2.7.1 乳酸菌活菌數(shù)測定 參考國家標準中食品乳酸菌檢測辦法[16],利用平板計數(shù)法對發(fā)酵乳中羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行分別計數(shù),測定時間為發(fā)酵乳后熟24 h后[17]。

1.2.7.2 感官評定 選擇10名食品專業(yè)且經(jīng)過感官培訓的人員,對發(fā)酵乳的色澤、滋味、氣味和組織狀態(tài)進行描述,并對其進行打分。感官評分如表2,具體標準參考國標[18]。以感官評分結(jié)果作為最終響應面實驗的評定結(jié)果。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring standard

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)均為三次重復試驗的平均值±標準差。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析,其中P<0.05表示兩組間數(shù)值差異顯著,P<0.01表示兩組間數(shù)值差異極顯著。使用Graph Pad Prism 7.00對數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)傳代過程中活菌數(shù)的變化

如圖1所示,羅伊氏乳桿菌LT018在傳至300代的過程中,活菌數(shù)的變化呈先上升后下降，然后趨于穩(wěn)定的趨勢。它在0代的活菌數(shù)較低,主要原因可能是長期處于低溫保存狀態(tài)下,菌株并未馬上完全適應培養(yǎng)基環(huán)境。在傳至100代時,活菌數(shù)達到最高值,說明LT018在100代附近最為活躍。從100～300代的過程中,活菌數(shù)的趨勢是先下降后平緩,LT018是一株適應能力強的菌株,在多次傳代過程中可能需要在基礎培養(yǎng)基上額外添加營養(yǎng)成分,以此來滿足其生長所需原料。但在整個傳代過程中,羅伊氏乳桿菌LT018的活菌數(shù)一直處于8.89～9.40lg CFU/mL之間的范圍,有較高的活菌總數(shù),說明該菌株在遺傳過程中活性穩(wěn)定。

圖1 羅伊氏乳桿菌LT018傳代過程中活菌數(shù)變化Fig.1 Changes in viable counts during the passage of Lactobacillus reuteri LT018

2.2 連續(xù)傳代過程中菌活力的變化

乳酸菌的產(chǎn)酸能力是判斷其是否適用于食品發(fā)酵乳的重要指標之一[19]。從實驗結(jié)果來看,第100代的產(chǎn)酸能力最強,可能是由于其在對數(shù)期間活菌數(shù)最多;從總體趨勢來看,從0～300代,羅伊氏乳桿菌LT018的產(chǎn)酸能力比較穩(wěn)定,酸度保持在38.44～40.01 °T的范圍內(nèi),說明這株羅伊氏乳桿菌在傳代過程中,產(chǎn)酸能力始終保持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi),適合作為食品發(fā)酵乳的發(fā)酵劑使用[20]。

2.3 連續(xù)傳代過程中菌株對人工胃、腸液的耐受能力

攝入益生菌后,在腸道內(nèi)存活能力的高低是評價益生菌是否能發(fā)揮其作用的標準之一[21],因此,耐受模擬胃、腸液是評價一株益生菌功能性的重要指標[22]。由實驗結(jié)果可知在連續(xù)培養(yǎng)300代的過程中,除第0代和其余代有明顯的差異外,羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)過模擬胃液的條件后,存活率均保持在在99%以上。李文靜等[23]在研究三株羅伊氏乳桿菌時,發(fā)現(xiàn)這三株菌在模擬胃液中的存活率為82.22%～91.65%,相比而言,本實驗使用的羅伊氏乳桿菌LT018在模擬胃液中的存活率遠高于這三株菌,說明羅伊氏乳桿菌LT018對于胃液的耐受能力更強。有研究表明,益生菌要發(fā)揮其益生作用,需要在腸道內(nèi)的存活量達到106CFU/d[24],而羅伊氏乳桿菌LT018在0～300代過程中依然能夠保持高于106CFU/mL的活菌數(shù),表明羅伊氏乳桿菌能夠在腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用。

表3 羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)傳代過程中在模擬胃液和腸液中的活細胞計數(shù)(lg CFU/mL)和存活率(%)Table 3 Viable cell count(lg CFU/mL)and survival rate(%)in simulated gastric and intestinal fluids during continuous passage of L. reuteri LT018

表4 羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)傳代過程中的凝集率Table 4 The agglutination rate during continuous passage of L.reuteri LT018

2.4 連續(xù)傳代過程中菌株的凝集性變化

在腸道內(nèi),菌株的自凝集能力是決定其是否能黏附到腸上皮細胞的重要因素[25],它們通過競爭宿主-細胞基質(zhì)結(jié)合位點阻止病原體的黏附和擴散[26]。羅伊氏乳桿菌LT018在0代時凝集率達到最高,為66.8%。在整個傳代過程中,50、100代之間的凝集率無顯著性差異(P>0.05),200～300代之間雖有顯著性差異(P<0.05),但整體凝集率始終保持在55.4%～66.8%的范圍內(nèi)。Klopper等[27]從成人糞便中篩選出幾種益生菌并對它測定了自凝集性,其中羅伊氏乳桿菌HFI-LD5的自凝集率在30.73%±6.17%。而羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)培養(yǎng)至300代的過程中,凝集率雖有上下波動的趨勢,但始終有著較高的凝集性,均高于羅伊氏乳桿菌HFI-LD5的凝集率,以此說明羅伊氏乳桿菌LT018在傳代過程中保持較強的黏附腸上皮細胞的能力。

2.5 發(fā)酵乳單因素實驗結(jié)果

2.5.1 溫度對發(fā)酵乳的影響 溫度對發(fā)酵乳感官評分和益生菌數(shù)的影響如圖3所示。隨著溫度的升高,發(fā)酵乳的感官評分和益生菌活菌數(shù)逐漸的升高,在40 ℃時,達到最高值,其中感官評定分數(shù)為86.1,益生菌活菌數(shù)為1.021×108CFU/mL。在41 ℃時感官評分和益生菌數(shù)有所下降，主要原因是溫度升高有利于酶活的提高[28],使細胞內(nèi)生命活動不斷加速,生長速率加快[29]。發(fā)酵溫度越高,乳酸菌發(fā)酵的效果越好,產(chǎn)酸也越多[19],到達80 °T的時間就越短。但同時,溫度過高會超過乳酸菌的最佳發(fā)酵溫度,會導致發(fā)酵乳品質(zhì)下降[30]。圖3表明,溫度在39、40、41 ℃范圍內(nèi)發(fā)酵乳的感官評定值較高,同時益生菌數(shù)量也保持在較高的水平。

2.5.2 白砂糖添加量對發(fā)酵乳的影響 糖添加量對發(fā)酵乳感官評分和益生菌數(shù)的影響如圖4所示。在糖添加量為1%～3%時,感官評分和益生菌活菌數(shù)都為上升的趨勢,添加量超過3%后,感官評分和活菌數(shù)呈相反的趨勢。白砂糖的添加量較低時,發(fā)酵乳滋味偏酸;添加量為3%時,感官評分最高;超過3%時,由于白砂糖添加過量,影響感官評分。而對益生菌活菌數(shù)而言,白砂糖可以作為乳酸菌的生長因子,促進乳酸菌的生長,所以呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢[31]。綜合分析選用添加量為2%、3%、4%進行下一步響應面試驗。

圖4 糖添加量對樣品感官評分和益生菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of sugar addition on the samples sensory score and probiotic count

2.5.3 菌種比例對發(fā)酵乳的影響 菌種比例對發(fā)酵乳感官評分和益生菌數(shù)的影響如圖5所示。當菌種為1∶1～2∶1時,感官評分持續(xù)上升;菌種比例超過2∶1后,感官評分有所下降。菌種比例直接影響到發(fā)酵乳的發(fā)酵程度[32]。普通發(fā)酵劑含量過高,則發(fā)酵乳發(fā)酵時間過快,發(fā)酵乳的持水力不好;益生菌發(fā)酵劑過高時,會導致產(chǎn)酸能力不足,發(fā)酵乳的狀態(tài)不佳。由圖5可知,比例為1.5∶1、2∶1、2.5∶1時,益生菌活菌數(shù)保持在較高的水平,同時感官效果較好。所以根據(jù)本實驗結(jié)果,選取菌種比例為:1.5∶1、2∶1、2.5∶1繼續(xù)下一步實驗。

圖5 菌種比例對樣品感官評分和益生菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of strain ratio on the samples sensory score and probiotic count

2.6 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

由單因素實驗結(jié)果得出三個因素的最佳范圍,設計了CCD中心組合試驗。利用Box-Behnken響應面分析法確定產(chǎn)品的最佳工藝參數(shù),如表5所示。

表5 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

對Design expert軟件對Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)進行二次項擬合,得到的回歸方程為:

Y=85.70+1.27A+2.83B+0.75C-1.22AB-0.0058AC-0.88BC-6.07A2-11.90B2-5.66C2。

其中,Y為感官評定的預測響應值,A為溫度,B為白砂糖添加量,C為菌種比例。表6為響應面回歸方程的方差分析結(jié)果(感官評定)。

由表6可知,所建立的模型極顯著(P=0.0001<0.001),模型的失擬項不顯著(P=0.3041>0.05),說明建立模型在整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合度較好,模型可信。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9983,校正系數(shù)R2adj=0.9960,說明預測值和試驗值的相關(guān)性高,CV值(變異系數(shù))較低為0.69%,說明模型具有較高的精確度,結(jié)果可信。由系數(shù)顯著性可知,因子的一次項A(溫度)、B(白砂糖添加量)、C(發(fā)酵劑混合比例)及二次項 A2、B2、C2對發(fā)酵乳口感均有極顯著影響。具體響應曲面圖如圖6所示。

表6 RSM回歸方程方差分析(感官評分)Table 6 RSM regression equation analysis of variance(sensory score)

圖6 溫度、菌種比例、糖添加量對感官評分影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of temperature, strain ratio,and sugar addition on sensory score

由響應面圖和等高線可以看出因素與因素的交互作用對響應值的影響程度。如圖6所示,交互項AB和BC之間的等高線均呈橢圓形,說明對于發(fā)酵乳感官評分來說,溫度與糖添加量和糖添加量與菌種比例之間的交互作用顯著。由響應面分析可知,回歸模型存在最大值。由回歸方程計算得到Y(jié)的最大估計值為85.70,此時溫度為40.00 ℃,糖添加量為3.00%,菌種比例為2∶1。

2.7 最佳工藝驗證實驗

根據(jù)響應面優(yōu)化后的實驗條件為:溫度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌種比例2∶1,進行三次平行實驗進行驗證。最終感官評分為86.63±1.47,此時益生菌活菌數(shù)達到1.033×108CFU/mL,與響應預測值擬合率為 98.92%,說明該響應面優(yōu)化參數(shù)準確,有一定的實際利用價值。

3 結(jié)論

羅伊氏乳桿菌LT018在傳至300代的過程中,其益生特性穩(wěn)定,在模擬的腸胃液環(huán)境中具有較高的存活性,菌株本身具有優(yōu)良的自聚合能力。羅伊氏乳桿菌LT018與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵水牛乳的最佳工藝是:發(fā)酵溫度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌種比例2∶1時,制品的感官評分為86.63,益生菌活菌數(shù)達到1.033×108CFU/mL。本研究對羅伊氏乳桿菌LT018的應用提供了理論與技術(shù)依據(jù)。