劉慧璐，范巧蘭，王 慧，李永山，席吉龍，楊 娜，席天元，常鐵牛，陶民剛

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

大豆最早起源于我國(guó)，是重要的油料作物和蛋白來(lái)源，因其營(yíng)養(yǎng)豐富全面，在日常生產(chǎn)生活中扮演著重要角色。自1996 年開(kāi)始商業(yè)化種植以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物已連續(xù)發(fā)展22 a。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）顯示[1]，2017 年轉(zhuǎn)基因作物種植面積創(chuàng)造了1.898 億hm2的新紀(jì)錄，種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家增加到24 個(gè)，美國(guó)、巴西、阿根廷位列前3。其中，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大，超過(guò)9 400 萬(wàn)hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的50%。大豆總面積的77%為轉(zhuǎn)基因大豆，而抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是主要品種。20 世紀(jì)我國(guó)仍是大豆出口國(guó)，但進(jìn)入21 世紀(jì)后我國(guó)大豆進(jìn)出口發(fā)生逆轉(zhuǎn)，2018 年全年進(jìn)口大豆達(dá)9 000 萬(wàn)t，是進(jìn)口量最大的農(nóng)產(chǎn)品。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，帶來(lái)了大量的經(jīng)濟(jì)效益，解決了許多地區(qū)糧食不足的問(wèn)題；但同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全性也引起人們的關(guān)注[2-6]。

土壤處于巖石圈的表層，與地表環(huán)境緊密相連、息息相關(guān)。土壤微生物參與土壤物質(zhì)傳遞和能量循環(huán)，可以表征土壤養(yǎng)分狀況和修復(fù)污染土壤[7-9]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源的目的基因轉(zhuǎn)入到本體內(nèi)，改變了本體的農(nóng)藝性狀或生理代謝，從而實(shí)現(xiàn)作物的高產(chǎn)高效[10]。轉(zhuǎn)基因作物大面積種植勢(shì)必會(huì)使得轉(zhuǎn)基因成分或者轉(zhuǎn)基因作物分泌物進(jìn)入土壤，這可能會(huì)引起土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和多樣性變動(dòng)，進(jìn)而影響土壤的生態(tài)環(huán)境[11]。國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)微生物影響的研究，但研究結(jié)果存在分歧。有研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤特定微生物沒(méi)有影響；而有研究表明，轉(zhuǎn)基因作物改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[12-15]。目前，我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆還沒(méi)有進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，但對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)已展開(kāi)相關(guān)研究，關(guān)于轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤微生物研究主要集中在東北黑土區(qū)[10-11]。但研究的結(jié)論不一致。

本試驗(yàn)采用盆栽和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法結(jié)合，對(duì)種植耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的影響進(jìn)行研究，旨在為轉(zhuǎn)基因大豆的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供一定科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2 個(gè)耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆品種TN1和94Y20 以及1 個(gè)非轉(zhuǎn)基因大豆品種運(yùn)豆101。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)。盆栽所用土壤取自農(nóng)場(chǎng)，土壤類(lèi)型為黃壤土，速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為65，7，86 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量0.89%，pH 值7.12，未種植任何轉(zhuǎn)基因作物。試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理，每個(gè)處理代表一個(gè)品種，共有15 次重復(fù)。播種前，土壤自然風(fēng)干，去掉石子、根系等雜質(zhì)過(guò)5 mm 篩，充分混勻。每盆裝土7 kg，播前定量澆水，每千克土施用0.15 g N、0.1 g K2O 和0.1 g P2O5。2018 年5 月11 日播種，每盆播種2 粒品質(zhì)好的種子，出苗后定苗1 株，定期定量澆水，每15 d 變換一次位置，并采取病蟲(chóng)害防治措施。

分別在大豆苗期（6 月25 日）、花期（7 月18 日）、鼓粒期（9 月25 日）和成熟期（10 月9 日）采集根區(qū)土樣。每盆在根系周?chē)? 鉆，去根系雜質(zhì)混勻?yàn)橐粋€(gè)重復(fù)，各生育期每個(gè)處理取3 次重復(fù)。裝入密封袋冷藏在4 ℃和－80 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

土壤微生物計(jì)數(shù)采用稀釋平板培養(yǎng)法，將土樣研磨加入無(wú)菌水，逐級(jí)稀釋至需要的倍數(shù)，接種至平板培養(yǎng)基涂抹均勻。采用不同培養(yǎng)基對(duì)土壤微生物進(jìn)行分類(lèi)，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，固氮菌和氨化細(xì)菌采用蛋白胨牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基（配比不同），詳情參考文獻(xiàn)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤細(xì)菌的影響

由表1 可知，3 種大豆土壤細(xì)菌數(shù)量隨生育進(jìn)程逐漸增加，至鼓粒期達(dá)到最大，然后降低。其中，苗期，轉(zhuǎn)基因品種94Y20 和TN1 土壤細(xì)菌數(shù)量比運(yùn)豆101 分別提高了70.59%和17.65%，但差異不顯著；花期細(xì)菌數(shù)量大小依次為94Y20＞運(yùn)豆101＞TN1，三者差異不顯著；鼓粒期94Y20 和TN1 較運(yùn)豆101 顯著降低了土壤細(xì)菌數(shù)量；成熟期94Y20 和運(yùn)豆101 差異不顯著，但與TN1 差異均達(dá)顯著水平。4 個(gè)生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因大豆TN1 的細(xì)菌最少。

表1 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤細(xì)菌的影響 ×106 cfu/g

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤真菌的影響

從表2 可以看出，轉(zhuǎn)基因大豆94Y20 和非轉(zhuǎn)基因大豆運(yùn)豆101 土壤真菌數(shù)量隨生育進(jìn)程推進(jìn)呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，至花期達(dá)最多；TN1 土壤真菌數(shù)量不同生育時(shí)期變化不大；苗期TN1 土壤真菌數(shù)量高于94Y20 和運(yùn)豆101，但差異不顯著；花期土壤真菌數(shù)量運(yùn)豆101 和94Y20 顯著高于TN1，但94Y20 與運(yùn)豆101 間差異不顯著；鼓粒期和成熟期，運(yùn)豆101 土壤真菌數(shù)量略高于轉(zhuǎn)基因品種94Y20 和TN1，但三者差異均未達(dá)到顯著水平。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤真菌的影響 ×104 cfu/g

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤放線菌的影響

從表3 可以看出，3 個(gè)大豆品種放線菌數(shù)量隨生育進(jìn)程推進(jìn)上下波動(dòng)，表現(xiàn)為先降低之后升高再降低，數(shù)量大小依次為鼓粒期＞成熟期＞苗期＞花期；苗期轉(zhuǎn)基因大豆TN1 和94Y20 土壤放線菌數(shù)量低于運(yùn)豆101，但差異不顯著；花期，放線菌數(shù)量大小依次為T(mén)N1＞運(yùn)豆101＞94Y20；鼓粒期放線菌數(shù)量大小依次為T(mén)N1＞運(yùn)豆101＞94Y20；成熟期放線菌數(shù)量大小依次為T(mén)N1＞94Y20＞運(yùn)豆101。3 個(gè)品種間各生育期差異均未達(dá)到顯著水平。

表3 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤放線菌的影響 ×106 cfu/g

2.4 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤固氮菌的影響

由表4 可知，3 種大豆土壤固氮菌數(shù)量在生育期內(nèi)變化趨勢(shì)相似，苗期轉(zhuǎn)基因大豆94Y20 和TN1與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，顯著提高了土壤固氮菌數(shù)量；其他生育期則相反，轉(zhuǎn)基因大豆品種94Y20 和TN1減少了固氮菌數(shù)量，但差異均未達(dá)到顯著水平。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤固氮菌的影響 ×104 cfu/g

2.5 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤氨化細(xì)菌的影響

由表5 可知，2 個(gè)轉(zhuǎn)基因品種土壤氨化細(xì)菌數(shù)量隨著生育進(jìn)程推進(jìn)呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，至鼓粒期達(dá)到最高；非轉(zhuǎn)基因品種運(yùn)豆101 土壤氨化細(xì)菌數(shù)量也是鼓粒期達(dá)到最大值，然后下降。苗期，與非轉(zhuǎn)基因品種運(yùn)豆101 相比，2 個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆降低了氨化細(xì)菌數(shù)量，且差異達(dá)到顯著水平；花期，土壤氨化細(xì)菌大小為T(mén)N1＞94Y20＞運(yùn)豆101，但三者差異未達(dá)到顯著水平；鼓粒期土壤氨化細(xì)菌大小為94Y20＞運(yùn)豆101＞TN1，但三者差異未達(dá)到顯著水平；成熟期土壤氨化細(xì)菌大小依次為T(mén)N1＞運(yùn)豆101＞94Y20，但三者差異未達(dá)到顯著性水平。

表5 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤氨化細(xì)菌的影響 ×105 cfu/g

3 結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要部分，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)微生物具有潛在的影響。已有研究表明，轉(zhuǎn)入的抗逆等基因可通過(guò)作物組織凋落和分泌物滲透的形式進(jìn)入土壤中[19]，進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)遺傳發(fā)育可改變微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性[20]；或者轉(zhuǎn)入基因可改變受體的生理活動(dòng)和農(nóng)藝性狀，基因表達(dá)的蛋白組織和生理代謝產(chǎn)生的根系分泌物進(jìn)入到土壤中，引起根區(qū)環(huán)境變化，從而對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響[20]。

陶波等[21]采用盆栽試驗(yàn)研究轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)根際和非根際土壤微生物數(shù)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種植天數(shù)轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比顯著增加或者減少微生物數(shù)量。劉佳等[22]采用室外小區(qū)和平板培養(yǎng)相結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆降低了土壤細(xì)菌、放線菌和氨化細(xì)菌數(shù)量，提高了真菌數(shù)量。沈彬等[23]采用qPCR 和高通量測(cè)序研究分析轉(zhuǎn)基因大豆土壤細(xì)菌豐度和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的大豆（G10-epsps）對(duì)土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群沒(méi)有影響，但增加了結(jié)莢期細(xì)菌的豐度和多樣性，改變了部分優(yōu)勢(shì)種群的豐度。徐廣惠等[17]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)研究轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）對(duì)土壤細(xì)菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RRS 降低了土壤細(xì)菌數(shù)量；采用DGGE-cloning方法研究發(fā)現(xiàn)，RRS 改變了細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤細(xì)菌有抑制作用。劉根林等[24]采用磷脂脂肪酸（PLFA）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆改變了花期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究得出，轉(zhuǎn)基因大豆TN1 和94Y20 顯著降低了鼓粒期細(xì)菌數(shù)量，改變了花期土壤真菌數(shù)量，這與徐廣惠和劉根林研究結(jié)果相似。王麗娟等[25]利用Biolog 技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因大豆大田種植對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆（PAT 和ALS）對(duì)微生物群落均一度、優(yōu)勢(shì)度和碳源利用類(lèi)型無(wú)明顯差異，但微生物活性提高。

轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤放線菌影響不顯著，在個(gè)別生育期對(duì)細(xì)菌、真菌、固氮菌和氨化細(xì)菌有影響。但由于生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性和微生物群落的多樣性，需要結(jié)合多種研究方法對(duì)土壤微生物進(jìn)行深入研究，以期得到更可靠的結(jié)論。