韋海典，陳學(xué)秋，黃艷，時恒枝，周靜茹，吳飛，杜愛芳，楊怡

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-FAR-4蛋白的表達(dá)特性及其與配體結(jié)合能力分析

韋海典，陳學(xué)秋，黃艷，時恒枝，周靜茹，吳飛，杜愛芳，楊怡

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，杭州 310058）

【】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲()寄生在牛羊等反芻動物的皺胃中，引起的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病在我國呈全國性流行。文章通過研究脂肪酸與視黃醇結(jié)合相關(guān)蛋白Hc-FAR-4的表達(dá)特性及配體結(jié)合能力，以了解其在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長、發(fā)育、繁殖過程中的作用。對進(jìn)行克隆、并且構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-，pET-30a-重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR與雙酶切鑒定準(zhǔn)確無誤之后轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，用0.1 mmol·L-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。收集重組蛋白rHc-FAR-4，利用熒光分析法，研究rHc-FAR-4蛋白與DAUDA、視黃醇、油酸的結(jié)合能力。配體結(jié)合試驗是依據(jù)熒光物質(zhì)retinol與脂肪酸類似物DAUDA在極性和非極性溶液中，在某一波長的激發(fā)光激發(fā)下，所發(fā)出的熒光光譜隨之變化的特性，判斷rHc-FAR-4蛋白是否具有與DAUDA、retinol結(jié)合的能力。再在體系中加入非熒光長鏈脂肪酸油酸，根據(jù)熒光光譜的變化情況判定油酸能否分別與DAUDA、retinol競爭目的蛋白的脂肪酸結(jié)合位點，間接說明目的蛋白能否與非熒光脂肪酸油酸結(jié)合。同時制備鼠源多克隆抗體，利用ELISA技術(shù)檢驗免疫后小鼠的抗體效價，抗體效價合適即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫組織熒光（IHF）試驗，探究Hc-FAR-4的表達(dá)部位，從而推測其功能。該試驗過程為：對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片，抗原修復(fù)，3%的BSA 于4℃封閉過夜，自制鼠源多克隆抗體作為一抗孵育1 h； Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG作為二抗避光孵育1 h，DAPI染色30 min，激光共聚焦顯微鏡檢查染色情況。利用熒光定量PCR技術(shù)分析在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各個主要階段的表達(dá)特性。成功克隆目的基因，測序結(jié)果與Sanger數(shù)據(jù)庫中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因序列（>HCISE00908800.t1）相似度為 99.9%；重組質(zhì)粒pET-30a-在BL21中成功表達(dá)，在誘導(dǎo)8 h后達(dá)到峰值。經(jīng)過ELISA檢測，結(jié)果顯示制備的鼠源多克隆抗體效價達(dá)到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000，可用于后續(xù)試驗。Western Blot鑒定結(jié)果顯示rHc-FAR-4重組蛋白帶有His標(biāo)簽，并且條帶大小為25 kD，結(jié)果符合預(yù)期。制備的鼠源多克隆抗體經(jīng)過Western Blot鑒定，能夠與天然Hc-FAR-4 蛋白結(jié)合，說明該抗體可用于IHF試驗。配體結(jié)合試驗結(jié)果表明 rHc-FAR-4蛋白具有結(jié)合脂肪酸與視黃醇的能力。熒光定量PCR分析表明，在四期幼蟲中的轉(zhuǎn)錄水平最高；IHF試驗表明，Hc-FAR-4主要表達(dá)在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的腸壁、性腺中。綜上推測Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活階段參與了轉(zhuǎn)運脂肪酸與視黃醇，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的生長發(fā)育與生殖提供營養(yǎng)物質(zhì)。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 FAR-4 蛋白能夠結(jié)合脂肪酸類似物DAUDA和視黃醇，但是與油酸的結(jié)合能力較弱，主要表達(dá)在腸壁，在性腺、角皮中也有少量表達(dá)，其基因在進(jìn)行營寄生生活階段時表達(dá)量達(dá)到峰值。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；；表達(dá)特性；配體結(jié)合能力；脂肪酸

0 引言

【研究意義】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（）成蟲寄生在牛羊等反芻動物的皺胃中是反芻動物常見的胃腸道線蟲之一，屬毛圓科（）、血矛屬（），其引起的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病主要癥狀為貧血、消瘦，感染嚴(yán)重可引起患病動物大批死亡[1-2]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病在我國全國性流行，其感染率為26.4%—80%[3-4]。目前防控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的方法仍是以藥物防控為主，但抗藥性問題日益凸顯[5]。在世界范圍內(nèi)，越來越多的抗藥蟲株被相繼報道[6-8]。因此，需要研發(fā)新型抗線蟲藥，而藥物作用靶標(biāo)的篩選已成為藥物開發(fā)的主要方向，并且理想的藥物靶標(biāo)通常為病原體感染、存活以及繁殖過程中所必需，而與宿主有明顯區(qū)別的代謝通路中[9-11]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長經(jīng)歷兩個階段，第一個是需氧的自由生活階段，第二個是微氧的寄生生活階段。這兩個階段生活條件的不同決定了其有不同的能量代謝與脂肪酸代謝方式。這獨特的能量代謝方式為新型藥物的研發(fā)提供了潛在的藥物靶位點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在線蟲體內(nèi)存在兩類特有的與脂結(jié)合有關(guān)的蛋白，脂肪酸視黃醇結(jié)合蛋白（fatty acid- and retinol-binding proteins，F(xiàn)ARs）和線蟲聚合蛋白抗原（Nematode polyprotein allergens/antigens，NPAs）[12]。其中第一個FAR蛋白是在旋盤尾絲蟲（）中發(fā)現(xiàn)的，其被命名為，之后學(xué)者對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究[13-14]。接下來在犬鉤口線蟲、秀麗隱桿線蟲、錫蘭鉤口線蟲等線蟲體內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)了FAR蛋白[15-17]。直到2009年，框麗薩利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)分析，才發(fā)現(xiàn)在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)也存在FARs蛋白并且預(yù)測在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)至少存在6種脂肪酸視黃醇結(jié)合蛋白[18]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-FAR-4蛋白的功能研究較少，本研究擬利用熒光分析法、熒光定量PCR技術(shù)、免疫組織熒光技術(shù)對Hc-FAR-4蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對原核表達(dá)的 rHc-FAR-4 蛋白進(jìn)行體外配體結(jié)合試驗，確定 rHc-FAR-4 蛋白的脂肪酸與視黃醇結(jié)合能力；利用熒光定量PCR技術(shù)對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育過程中各個時期的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，并制備鼠源多克隆抗體，對Hc-FAR-4蛋白在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中的表達(dá)特性進(jìn)行探討。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2017年3月至2018年9月在浙江大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所寄生蟲病理生物學(xué)研究室進(jìn)行。

1.1 蟲體、菌株與質(zhì)粒

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ZJ株成蟲在桐鄉(xiāng)屠宰場獲得并由浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；TOP10菌株、BL21（DE3）菌株和 pET-30a(+)vector質(zhì)粒由本實驗室制備并保存；pMD19-T vector質(zhì)粒購買于TaKaRa。

1.2 試劑與試劑盒

限制性內(nèi)切酶HI和dIII、T4 DNA連接酶、 LA TaqTM酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen 公司。DAUDA購買自Cayman公司。Bio-Rad 蛋白濃度測定試劑盒、Millipore 超濾管（Promega）。Ni-NTA 親和色譜樹脂、考馬斯亮藍(lán)購自 Qiagen 公司。油酸、視黃醇、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體、羊抗鼠IgG H&L（Alexa Fluor? 488）均購自美國Sigma公司。

1.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-far-4 基因的克隆

根據(jù)序列設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，引物序列為-F：CGCATGATCCGTCCGGTTGCTGCT（下劃線HI的識別位點）R：CCCCTAGTTGTTGATCAGCATCCTCGCCT（下劃線為dIII的識別位點），生工生物工程（上海）有限公司負(fù)責(zé)合成。提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為擴(kuò)增模板，用 LA TaqTM酶進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min ，共30個循環(huán)；72℃ 10 min?；厥詹⒓兓驪CR 產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行過夜連接，然后轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中挑取陽性克隆送到測序公司進(jìn)行測序分析。

1.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 Hc-FAR-4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)

用限制性內(nèi)切酶HI和dIII同時對測序準(zhǔn)確pMD19-T-質(zhì)粒與原核表達(dá)pET-30a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，T4 DNA 連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定準(zhǔn)確的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），挑取陽性克隆，-80℃凍存。保存的BL21菌液1﹕100比例加入600 ml的含卡那霉素的 LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)大概3 h到對數(shù)期，OD值0.6。IPTG（1 mol·L-1）按照1﹕1000的比例稀釋并添加到600 ml LB液體培養(yǎng)基中，搖床200 r/min，37℃，誘導(dǎo)6 h。在4℃條件下 8 000×g 離心 5 min富集、去上清。用5×PBS緩沖液（pH = 7.4）重懸細(xì)菌，冰浴下進(jìn)行超聲波破碎。12 000×g，4℃離心 10 min，收集上清。取10 μL上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.5 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 rHc-FAR-4蛋白的分離純化和Western Blot 鑒定

收集含有 rHc-FAR-4蛋白的上清液，加入鎳瓊脂糖凝膠柱中，流速約為 1 mL·min-1，過柱3次。用含有不同咪唑濃度的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速約為 2 mL·min-1，收集洗脫液。含有目的蛋白含量最多的洗脫液用超濾管進(jìn)行超濾除去咪唑并濃縮蛋白，檢測蛋白濃度。最后進(jìn)行Western Blot 鑒定，將純化后的rHc-FAR-4蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂乳（TPST配制）封閉過夜，一抗為抗 His 標(biāo)簽鼠源單克隆抗體（1﹕1 000）室溫孵育2 h，二抗為HRP -羊抗小鼠 IgG（1﹕5 000）室溫孵育1 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色。

1.6 重組蛋白與配體的結(jié)合能力

根據(jù)熒光物質(zhì)retinol與脂肪酸類似物DAUDA在極性和非極性溶液中，在某一波長的激發(fā)光激發(fā)下，所發(fā)出的熒光光譜隨之變化的特性，利用熒光分析法，通過熒光光譜的變化判斷rHc-FAR-4蛋白是否具有與DAUDA、retinol結(jié)合的能力[18]。再在體系中加入非熒光長鏈脂肪酸油酸，根據(jù)熒光光譜的變化情況判定油酸能否分別與DAUDA、retinol競爭目的蛋白的脂肪酸結(jié)合位點，間接說明目的蛋白能否與非熒光脂肪酸油酸結(jié)合[19]。用乙醇把DAUDA（Cayman）、油酸（Sigma）、視黃醇（Sigma）配成儲存液，濃度為10 mmol·L-1，-20℃保存并且盡快使用。純化好的蛋白，再用超濾管超濾以除去咪唑。重組蛋白與DAUDA的結(jié)合試驗分為4個組，一是空白對照組：DAUDA + PBS；二是蛋白配體結(jié)合組：DAUDA + rHc-FAR-4 + PBS；三是競爭結(jié)合組：DAUDA + rHc-FAR-4 +油酸+ PBS；四是陰性對照組：DAUDA + rTg-PME + PBS。重組蛋白與retinol的結(jié)合試驗也分為4個組，一是空白對照組：retinol + PBS；二是蛋白配體結(jié)合組：retinol + rHc-FAR-4 + PBS；三是競爭結(jié)合組：retinol + rHc-FAR-4 + 油酸+ PBS；四是陰性對照組：retinol + rTg-PME + PBS。試驗體系為：96孔板中每孔重組蛋白的終濃度為3 μmol·L-1，其他配體的終濃度都為10 μmol·L-1，總體積為100 μL，重復(fù)3個復(fù)孔，試驗重復(fù)3次。其中rTg-PME蛋白是來源于弓形蟲的一個重組蛋白，其與脂肪酸視黃醇轉(zhuǎn)運無關(guān)，故用來做陰性對照。DAUDA由345 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，retinol由350 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)[19]。激發(fā)之后進(jìn)行全波長掃描記錄發(fā)射光譜的變化。實驗儀器為熒光酶標(biāo)儀 Synergy H1（Biotek）。

1.7 不同發(fā)育時期表達(dá)特性

從浙江桐鄉(xiāng)湖羊屠宰場采集湖羊第四胃皺胃，在皺胃壁及胃內(nèi)容物中挑出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲。取出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌蟲剖開子宮取出蟲卵并鋪于瓊脂板中28℃培養(yǎng)。每天添加適量的D-hank’s液培養(yǎng)。蟲卵孵化后為一期幼蟲（L1），培養(yǎng)3 d后為二期幼蟲（L2），培養(yǎng)7 d后發(fā)育為三期幼蟲（L3），收集L3幼蟲對湖羊進(jìn)行攻蟲，分別剖胃收集四期幼蟲（L4）與成蟲。收集各個時期的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物-QF：CGCCTTTGTCTCCTCGTTCA，-QR：CCGTACTTCTTTGCGACCTCC。qRT- PCR（25 μl）使用SYBR Green預(yù)混液（TOYOBO）按照說明書進(jìn)行操作，熒光定量儀為ABI 7300 （Thermo）。熒光定量 PCR 反應(yīng)程序：50℃ 3 min，95℃ 1 min 1個循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，最后一個循環(huán)產(chǎn)生熔解曲線。樣品設(shè)置3個重復(fù)，取平均閾值（CT值）進(jìn)行分析。相對定量計算方法采用CT值比較法。使用Graphpad prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計分析。內(nèi)參基因為，其引物序列為：-QF TGTTCCATCACCCAAGGTATCC；-QR TGACAGACACAAGGTGGTTGAGAT。

1.8 多克隆抗體的制備與Western Blot 鑒定

純化的rHc-FAR-4-His蛋白與弗氏完全佐劑1﹕1混合、手動乳化，免疫昆明小鼠的蛋白用量為50 μg/只，腹部皮下注射進(jìn)行首次免疫。第7天，將rHc-FAR-4-His蛋白與弗氏不完全佐劑1﹕1混合、手動乳化，終濃度為25 μg/只，腹部皮下注射進(jìn)行二次免疫。第14天，以同樣的方法進(jìn)行第三次免疫。第21天，采血，ELISA檢測血清抗體效價，效價達(dá)到要求即可收集血清，-80℃保存。然后進(jìn)行Western Blot 鑒定，確認(rèn)制備的鼠源多克隆抗體是否能夠特異性識別天然Hc-FAR-4蛋白，并且以鼠源陰性血清作為陰性對照。其過程為，提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲全蟲蛋白并將全蟲蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂乳（TPST配制）封閉過夜，一抗為自制鼠源多克隆抗體（1﹕2 000）室溫孵育2 h，二抗為HRP -羊抗小鼠 IgG（ 1﹕5 000）室溫孵育1 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色。

新聞學(xué)產(chǎn)生于19世紀(jì)末20世紀(jì)初的西方發(fā)達(dá)資本主義國家。從時間上來看，新聞學(xué)還很年輕。但是作為普遍存在的新聞傳播活動卻早已開始。從最初的口頭新聞一直到如今的印刷媒介和電子媒介的新聞，新聞傳播經(jīng)歷了漫長的歷史過程。美學(xué)也有著同樣的命運。1750年，德國哲學(xué)家鮑姆加登的美學(xué)專著《美學(xué)》第一卷的出版，使“美學(xué)”這一名稱逐漸得到了學(xué)術(shù)界的公認(rèn)。從此，美學(xué)也逐漸成為了一門獨立的學(xué)科。因此，可以說美學(xué)也是一門年輕的學(xué)科。但是，人類審美意識和美學(xué)思想的歷史卻十分古老。從考古發(fā)現(xiàn)的洞穴壁畫到古希臘哲人的思辨再到現(xiàn)如今各種實用美學(xué)的興起，不得不說美學(xué)既古老而又年輕。

1.9 石蠟包埋

將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌性四期幼蟲用現(xiàn)配的4%多聚甲醛4℃固定 24 h，流水沖洗過夜[20 ]。脫水：50%乙醇溶液脫水30 min、75%乙醇溶液脫水30 min、80%乙醇溶液脫水30 min、95%乙醇溶液脫水30 min、100%Ⅰ乙醇溶液脫水5 min、100%Ⅱ乙醇溶液脫水5 min，逐級脫水。透明：置于二甲苯乙醇（1﹕1）溶液5 min，二甲苯透明 5 min[21-22]。浸蠟：透明好的樣品置于液態(tài)石蠟中浸泡1—2 h再進(jìn)行包埋。

1.10 免疫組織熒光

切片：25 μm粗切，切到組織后切換為5 μm細(xì)切，將切好的組織放入到42℃的水浴鍋中展片，玻片撈取?？酒呵衅糜?0℃烘箱3—6 h。脫蠟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液中各浸泡5 min。脫水：酒精逐級脫水?？乖迯?fù)：切片烤好后置于0.01 mol·l-1檸檬酸鹽緩沖液，開水浴20 min[23]。封閉：3% 的BSA 4℃封閉過夜。一抗孵育：鼠多抗（自制）用PBS 1﹕200 稀釋，37℃孵育1 h。洗滌：PBS 緩沖液清洗3次。二抗孵育：Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG用PBS 1﹕400稀釋，37℃避光孵育1 h。洗滌：PBS緩沖液清洗3次。核染：DAPI 37℃染色30 min。洗滌：PBS緩沖液清洗3次。封片：激光共聚焦顯微鏡拍照（Zeiss LSM 780，德國）。

2 結(jié)果

2.1 Hc-far-4 基因的克隆及其鑒定

以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲的cDNA作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在500 bp附近有一條清晰的條帶（圖 1-A）。回收連接后進(jìn)行測序，結(jié)果與 Sanger數(shù)據(jù)庫中公布的序列（>HCISE00908800.t1）相似度為 99.9%。挑選pET-30a-陽性克隆用HI和dIII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切后切出一條約500 bp的短片段與約4 000 bp的長片段（圖 1-B）。證明已成功轉(zhuǎn)入pET-30a中。

A.Hc-far-4序列擴(kuò)增結(jié)果；B. pET-30a-Hc-far-4酶切鑒定結(jié)果。M：DL250 DNA Maker；A-1：Hc-far-4 PCR 產(chǎn)物；B-1：pET-30a-Hc-far-4雙酶切產(chǎn)物

2.2 rHc-FAR-4蛋白的表達(dá)，純化及其鑒定

2.2.1 rHc-FAR-4蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將含有pET-30a-重組質(zhì)粒的BL21 擴(kuò)大培養(yǎng)約600 mL菌液，然后 IPTG在37℃環(huán)境中誘導(dǎo)8 h，收集菌，5×PBS（pH7.4）重懸，冰浴條件下超聲波破碎，離心收集上清進(jìn)行SDS-PAGE分析[24]（圖2）。根據(jù)EditSeq軟件的蛋白分子量預(yù)測與結(jié)合pET-30a 質(zhì)粒圖譜推測重組蛋白分子量大小約為25 kD。SDS-PAGE 結(jié)果顯示蛋白條帶大小與推測的結(jié)果一致，在上清中表達(dá)。

M：蛋白 Marker；1：pET-30a 空白對照；2：pET-30a-Hc-far-4 未誘導(dǎo)陰性對照；3：pET-30a-Hc-far-4 誘導(dǎo)4 h；4：pET-30a-Hc-far-4 誘導(dǎo)6 h；5：pET-30a-Hc-far-4 誘導(dǎo)8 h

2.2.2 rHc-FAR-4蛋白分離純化及鑒定 rHc-FAR-4 蛋白純化后用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，了解蛋白純化的情況。經(jīng)純化并超濾的 rHc-FAR-4 蛋白如圖3-A，蛋白大小為25 kD左右與推測的大小相似。rHc-FAR-4 蛋白以抗His 血清作為一抗進(jìn)行WB驗證，其結(jié)果顯示該蛋白帶有His標(biāo)簽，并且大小與推測的一致約為25 kD（圖3-B）。蛋白濃度檢測按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行，測得濃縮后rHc-FAR-4 蛋白濃度為2.0 μg·μL-1。

A. Hc-FAR-4重組蛋白的 SDS-PAGE 分析結(jié)果；B. rHc-FAR-4 Western Blot 鑒定結(jié)果。M：蛋白 Marker；A-1、B-1：rHc-FAR-4 蛋白

2.3 重組蛋白與配體的結(jié)合能力

在rHc-FAR-4與DAUDA結(jié)合能力的檢測中，用 345 nm 激發(fā)光激發(fā)僅含有 10 μmol·L-1DAUDA 的 PBS 溶液后，發(fā)射光譜的波峰位于 570 nm 處，且熒光強(qiáng)度較弱；而當(dāng)加入 3 μmol·L-1rHc-FAR-4蛋白后，熒光強(qiáng)度對比空白對照組和陰性對照組都明顯增強(qiáng)，且波峰移至 488 nm（圖4-A）；加入油酸和DAUDA競爭與rHc-FAR-4蛋白結(jié)合的位點，結(jié)果顯示加入油酸后熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。在rHc-FAR-4與retinol結(jié)合能力的檢測中用350 nm 激發(fā)光激發(fā)PBS+10 μmol·L-1retinol組成的空白對照組，其發(fā)射光譜的波峰位于 400 nm 處，且熒光強(qiáng)度較弱，而當(dāng)加入 3 μmol·L-1rHc-FAR-4蛋白后，發(fā)射光譜的波峰右移至420 nm處，熒光強(qiáng)度對比空白對照組增強(qiáng)了但是和陰性對照組的熒光強(qiáng)度差不多；加入油酸和DAUDA競爭與rHc-FAR-4蛋白結(jié)合的位點，結(jié)果顯示加入油酸后熒光強(qiáng)度沒有明顯變化（圖4-B）。

A：DAUDA配體結(jié)合試驗；B：Retinol配體結(jié)合試驗

2.4 rHc-FAR-4 鼠多抗的特異性檢測

用目的蛋白對昆明小鼠進(jìn)行三次免疫之后，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）法檢測昆明小鼠血清抗體效價，結(jié)果顯示效價較高達(dá)到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000，可用于后續(xù)試驗。收集的多克隆抗體利用Western blot方法鑒定其與全蟲蛋白的親和性，并用鼠陰性血清作為對照（圖5）。結(jié)果顯示制備的多克隆抗體能夠識別捻轉(zhuǎn)血矛線蟲全蟲蛋白中的天然Hc-FAR-4蛋白，條帶約為20 kD，比重組蛋白小一些。

2.5 不同發(fā)育時期表達(dá)特性

A：制備的鼠源多克隆抗體作為一抗；B：鼠源陰性血清作為一抗。M：蛋白marker，A-1、B-1：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲全蟲蛋白

圖6 Hc-far-4 在各個時期的轉(zhuǎn)錄水平

2.6 免疫組織熒光

為了確定Hc-FAR-4的表達(dá)部位，收集轉(zhuǎn)錄水平最高的時期即L4期雌蟲進(jìn)行石蠟包埋與切片，然后進(jìn)行免疫組織熒光染色。由試驗結(jié)果可以看出Hc-FAR-4的表達(dá)部位主要集中在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的腸壁中，在其性腺、角皮也有少量表達(dá)（圖7）。

3 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的生活史存在兩個階段，自由生活階段與寄生生活階段。其在寄生生活階段的營養(yǎng)物質(zhì)攝取涉及自身能否在宿主體內(nèi)生存和能否滿足自身繁殖需要，所以在營養(yǎng)物質(zhì)的攝取特別是在寄生生活階段的營養(yǎng)物質(zhì)攝取顯得尤為重要。其在攝取的營養(yǎng)物質(zhì)中脂肪酸與視黃醇的吸收與轉(zhuǎn)運意義重大。因為線蟲體內(nèi)缺乏脂肪酸和視黃醇的從頭合成能力，因此需要從寄主或環(huán)境中獲取這些物質(zhì)，為體內(nèi)的脂類合成或其它生理活動提供底物和能量[17, 25]。脂結(jié)合蛋白歷來受到科研人員的重視，其可能對宿主組織進(jìn)行修飾從而使寄生蟲逃避宿主的免疫；除此之外由于脂肪酸視黃醇不易溶于水，而且容易氧化，在游離狀態(tài)下會對細(xì)胞膜造成損害，所以脂肪酸、視黃醇的運輸一般都是與脂蛋白結(jié)合再進(jìn)行轉(zhuǎn)運的[19]。脂結(jié)合蛋白能夠結(jié)合宿主體內(nèi)的視黃醇和長鏈脂肪酸，促進(jìn)寄生蟲對這些營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，彌補(bǔ)寄生線蟲合成長鏈脂肪酸能力的不足[26]。

本次研究采用了熒光分析法，首次分析了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲rHc-FAR-4與DAUDA和視黃醇的結(jié)合情況，并且對試驗方法進(jìn)行了改良。儀器使用熒光酶標(biāo)儀H1而不是紫外分光光度計，使試驗更加簡單便捷的同時，根據(jù)配體結(jié)合試驗中空白對照組DAUDA與retinol的發(fā)射光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其光譜的峰值分別在570 nm和400 nm處，與文獻(xiàn)報道的發(fā)射光譜趨勢一致[19,25]，說明試驗方法的改良取得成功。在檢驗rHc-FAR-4能否與DAUDA結(jié)合的試驗中，蛋白配體結(jié)合試驗組熒光強(qiáng)度峰值對比空白對照組和陰性對照組的熒光強(qiáng)度峰值都明顯增強(qiáng)，且波峰移至 488 nm（圖4-A），這現(xiàn)象說明 rHc-FAR-4蛋白能夠結(jié)合 DAUDA且結(jié)合能力要比rTg-PME強(qiáng)。而蛋白結(jié)合試驗組與競爭結(jié)合試驗組的熒光發(fā)射光譜并沒有明顯的差別，說明油酸無法把DAUDA從rHc-FAR-4蛋白結(jié)合位點中置換出來，從而說明rHc-FAR-4與油酸的結(jié)合能力較弱。在檢驗rHc-FAR-4能否與retinol結(jié)合的試驗中，蛋白配體結(jié)合試驗組熒光強(qiáng)度峰值比空白對照組強(qiáng)且波峰移至420 nm處（圖4-A），但是和陰性對照組無明顯差別，說明rHc-FAR-4能夠與retinol結(jié)合，但是結(jié)合能力較弱，與rTg-PME的結(jié)合能力相近。蛋白結(jié)合實驗組與競爭結(jié)合試驗組的熒光發(fā)射光譜并沒有明顯的差別，說明油酸無法把retinol從rHc-FAR-4蛋白結(jié)合位點中置換出來，再次驗證rHc-FAR-4與油酸的結(jié)合能力較弱。這研究結(jié)果與脂結(jié)合蛋白能夠結(jié)合宿主體內(nèi)的視黃醇和長鏈脂肪酸促進(jìn)寄生蟲對這些營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以彌補(bǔ)寄生線蟲合成長鏈脂肪酸能力的不足，并為體內(nèi)的脂類合成或其它生理活動提供底物和能量等結(jié)論相符[17,25-26]。

A：陰性對照；B：蟲體橫切；C：蟲體縱切。a：腸壁；b：性腺；c：角皮；列1：DAPI核染色；列2：異硫氰酸熒光素信號；列3：透射光拍照；列4：圖片組合

通過熒光定量PCR技術(shù)檢測了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各個發(fā)育時期蟲體中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)其在營自由生活的蟲卵、L1、L2階段表達(dá)量很低，但是在開始營寄生生活前期即L3階段開始顯著增加，在營寄生生活的L4階段達(dá)到峰值，在營寄生生活的成蟲階段表達(dá)量也相對較高。說明Hc-FAR-4蛋白在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的入侵宿主的過程中扮演重要角色。這與研究報道中的脂結(jié)合蛋白能對宿主組織進(jìn)行修飾從而使寄生蟲逃避宿主免疫的推測相吻合[27-28]。

在此之前對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)蛋白定位都是對L1—L3幼蟲進(jìn)行免疫熒光定位的[29-31]，因為這些時期的幼蟲生活在體外，容易培養(yǎng)與獲得。但是存在以下幾個弊端：一是有的蛋白在這幾個時期表達(dá)量不高甚至不表達(dá)故無法檢測；二是由于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體有厚厚的鞘所包裹，即使有脫鞘的方法，但是存在較難脫鞘或者是脫鞘不完全情況；三是即使脫掉鞘，進(jìn)行免疫熒光定位也無法準(zhǔn)確指出所表達(dá)的具體部位。本次試驗對試驗方法進(jìn)行改良，對四期幼蟲、成蟲甚至L3期幼蟲蟲體進(jìn)行石蠟包埋，切片，進(jìn)行IHF試驗，就能探究蛋白在這些時期的表達(dá)部位。并且根據(jù)組織形態(tài)的不同，可以較為準(zhǔn)確地指出蛋白的具體表達(dá)部位。本試驗選擇了轉(zhuǎn)錄水平最高的四期雌性幼蟲進(jìn)行包埋，探究Hc-FAR-4在這個時期蟲體中的定位。在縱切組圖與橫切組圖中，可以看到綠色熒光物質(zhì)標(biāo)記了的羊抗鼠二抗主要結(jié)合在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的腸壁，少量結(jié)合在性腺、角皮且對照組并沒有發(fā)現(xiàn)綠色熒光，說明制備的鼠源多抗能夠特異性結(jié)合捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)的Hc-FAR-4蛋白。推測Hc-FAR-4蛋白主要參與了營寄生生活階段的脂肪酸與視黃醇的轉(zhuǎn)運，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的生長發(fā)育與生殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時Hc-FAR-4蛋白在角皮也有表達(dá)，可能與防止捻轉(zhuǎn)血矛線蟲機(jī)體被宿主體內(nèi)游離的脂肪酸、視黃醇所損傷有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究利用BL21對進(jìn)行了原核表達(dá)，配體結(jié)合試驗結(jié)果表明該重組蛋白rHc-FAR-4能夠結(jié)合脂肪酸類似物DAUDA和視黃醇，但是與油酸的結(jié)合能力較弱。IHF結(jié)果表明Hc-FAR-4蛋白主要表達(dá)在腸壁，在性腺、角皮中也有少量表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示在進(jìn)行營寄生生活階段表達(dá)量達(dá)到峰值。

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The Expression Pattern and Ligand Binding Ability of Hc-FAR-4 Protein of

WEI HaiDian, CHEN XueQiu, HUANG Yan, SHI HengZhi, ZHOU JingRu,WU Fei, DU AiFang, YANG Yi

(College of Animal Science, Zhejiang University/Key Laboratory of Animal Preventive Medicine of Zhejiang Province, Hangzhou 310058)

【】is a parasite mainly settled in the abomasum mucosa of small ruminants. The disease caused byis a national epidemic in China. In this paper, the expression pattern and ligand binding ability of Hc-FAR-4 were studied to understand its role in the growth, development and reproduction of【】The prokaryotic expression vector pET-30a-was constructed, which was identified by PCR and enzyme digestion identification, and then, the recombinant plasmid was transformed intoBL21. The recombinant protein was induced by 0.1 mmol·l-1IPTG (isopropyl-β-d-thiogalactoside). The recombinant protein rHc-FAR-4 was collected and was identified by Western Blot. Fluorescence analysis method, and then, which was used to study the binding ability of Hc-FAR-4 protein with DAUDA, retinol, and oleic acid. The IHF experiment was based on the fluorescent material retinol and fatty acid analogues DAUDA in polar or nonpolar solution, and their excitation spectra characteristics would change when they were excitated by a certain wavelength of exciting light. Using fluorescence analysis method, we could estimate whether rHc-FAR-4 protein contained the ability to bind with DAUDA and retinol by the change of the excitated spectra. When non-fluorescent oleic acid was added into the system, it would compete with DAUDA and retinol to bind with the bind site of rHc-FAR-4 protein, and which would make excitated spectral change, too. According to the changes, we could indirectly judge whether rHc-FAR-4 protein could bind with non-fluorescent oleic acid. At the same time, polyclonal antibodies were prepared by using rHc-FAR-4 protein to immunize mice, and the antibody titer of the immunized mice was tested by ELISA. The serum of the immunized mice would be collected if the antibody titer was appropriate. The collected serum was used in the immunofluorescence (IHF) experiment to explore the expression site of Hc-FAR-4 protein to speculate its function in. The IHF experiment process was as follow: Thewas embedded in paraffin; the paraffin wascut into slices; Antigen was repaired; the slices was incubated by 3% BSA at 4℃ for one night; slices was incubated by anti-Hc- FAR-4 mouse antibody and Alexa Fluor? 488 nm goat anti-mouse IgG antibody for 1 h, and which was done as primary and secondary antibody,respectively; after staining by DAPI, the slices were observed by confocal microscopy. What’smore, the qPCR technology was used to analyze the expression characteristics of【】The target genewas successfully cloned. The recombinant plasmid pET-30a-was successfully expressed inBL21. The recombinant plasmid pET-30a-Hc--4 was successfully expressed inBL21, and the expression level of rHc-FAR-4 protein reached peak after induction for 8h. The result of ELISA showed that the titer of mouse polyclonal antibody was 1:1 024 000—1:2 048 000, which could be used in the following experiments. Western Blot result showed that the rHc-FAR-4 protein contained His tag and the band size was 25 kD, which was consistent with the prediction. The mouse polyclonal antibody was identified by Western Blot and could bind to natural Hc-FAR-4 protein, indicating that the antibody could be used in IHF experiment. The results of ligand binding experiments of rHc-FAR-4 showed that rHc-FAR-4 could bind to fatty acids and retinol. The qPCR analysis showed thatreached the highest transcription level in the fourth stage larvae. Immunohistofluorescence assay showed that Hc-FAR-4 was mainly expressed in the intestinal wall and gland of. To sum up, it could be speculated that Hc-FAR-4 protein might be involved in the transport of fatty acids and retinol, and provided nutrients forto ensure its normal growth, development and reproduction; what，s more, Hc-FAR-4 protein maybe also involved in the process of modifying host tissues to enable the parasite to escape the immunity of host.【】rHc-FAR-4 could bind to DAUDA and retinol, and which was mainly expressed in the intestinal wall, cuticle and gonad. The transcription level ofreached the peak in the fourth stage larvae.

;; expression pattern; ligand binding capacity; fatty acids

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.013

2018-12-06；

2019-02-26

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0501200）、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2015CB150300）、國家自然科學(xué)基金（31602041）

韋海典，E-mail：757559545@qq.com。通信作者楊怡，E-mail：yangyi0607@zju.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）