羅龍?jiān)?，林小愛，?峰，曾凡健，張邦喜，劉 燁，田光明，*

(1.上饒師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.浙江大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；4.貴州省農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，貴州 貴陽 550006)

微藻是一類光合作用效率很高的初級(jí)生產(chǎn)者，其利用太陽能固定CO2的效率是其他陸生植物的10～50倍[1]。同時(shí)，微藻具有不與糧爭(zhēng)地、生長周期短、生長速度快，以及油脂含量高等特點(diǎn)，可作為生產(chǎn)生物質(zhì)能的理想原材料[2]。然而，微藻培養(yǎng)過程中需要吸收大量的養(yǎng)分，成本較高。近年來，很多學(xué)者嘗試采用各種廢水來培養(yǎng)微藻，既收獲了微藻，又使水質(zhì)得到了凈化[3-7]。各種廢水中，養(yǎng)豬廢水因氮、磷豐富，可為微藻生長提供充足的養(yǎng)分來源。

養(yǎng)豬廢水中的氮素主要為氨氮。氨氮是大多數(shù)微藻優(yōu)先利用的氮素形式[8]，但是當(dāng)廢水中的氨氮濃度超過微藻耐受范圍時(shí)，會(huì)對(duì)微藻生長產(chǎn)生抑制作用，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致藻體死亡[9-12]。養(yǎng)豬廢水中氨氮的質(zhì)量濃度很高，從幾百毫克每升到上千毫克每升不等[13]，直接用其培養(yǎng)微藻并不可行；因此，利用養(yǎng)豬廢水培養(yǎng)微藻前，須對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。目前，主要的預(yù)處理方法包括厭氧發(fā)酵[6-7]和稀釋[7，14]。厭氧發(fā)酵法只能降低養(yǎng)豬廢水中的有機(jī)物含量[15]，對(duì)氨氮的去除效果不顯著[16]；稀釋法雖然可以降低廢水中的養(yǎng)分含量[17]，但需消耗大量的水資源，增加了培養(yǎng)成本。因此，有必要尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的養(yǎng)豬廢水預(yù)處理方法。

本文選取對(duì)養(yǎng)豬廢水凈化效果好的近具刺鏈帶藻作為研究對(duì)象，考查其在不同質(zhì)量濃度氨氮廢水中的生長情況，探討曝二氧化碳?xì)怏w對(duì)提高微藻在高質(zhì)量濃度氨氮廢水中生長能力的效果，旨在為實(shí)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水規(guī)?；囵B(yǎng)微藻的資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)所用的近具刺鏈帶藻(Desmodesmussp. CHXl)由本課題組從養(yǎng)豬廢水中分離獲得[21]。收集處于對(duì)數(shù)期的藻細(xì)胞，經(jīng)1 μm醋酸纖維濾膜(上海新亞)過濾后，用超純水洗凈再次過濾。使用帶針頭的注射器抽取一定體積的模擬廢水將濾膜上的微藻沖洗至500 mL錐形瓶中，記錄沖洗所用的模擬廢水體積，繼續(xù)向錐形瓶中加入模擬廢水，使錐形瓶中的模擬廢水總體積為400 mL。

所用的模擬廢水在BG11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)配制而成，即將BG11中的硝酸鈉替換為硫酸銨，且硫酸銨在不同處理下的用量不同，以確保達(dá)到設(shè)定的初始氨氮質(zhì)量濃度，其他成分的質(zhì)量濃度(mg·L-1)如下：K2HPO4·3H2O 40，MgSO4·7H2O 75，F(xiàn)e(NH4)3C18H10O146，CaCl2·2H2O 36，Na2CO320，檸檬酸6，Na2-EDTA 1，另加入A5溶液 1 mL·L-1。A5溶液組成：H3BO32.86 g，MnCl2·4H2O 1.81 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.079 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.39 g，Co(NO3)2·6H2O 0.049 g，加雙蒸水至1 000 mL。

參照文獻(xiàn)[22]設(shè)置適合近具刺鏈帶藻生長的條件：每天24 h全光照，光照強(qiáng)度為7 000 lx，溫度30 ℃。將所有試驗(yàn)錐形瓶放置在光照培養(yǎng)箱中，按照上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。錐形瓶底部設(shè)有磁力攪拌器，攪拌速率為1 000 r·min-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同質(zhì)量濃度氨氮廢水對(duì)微藻生長的影響

由于養(yǎng)豬廢水中的氨氮質(zhì)量濃度一般在200～1 000 mg·L-1[13]，故本文配制的5種廢水的初始氨氮質(zhì)量濃度分別為350 mg·L-1(T1)、450 mg·L-1(T2)、600 mg·L-1(T3)、750 mg·L-1(T4)、900 mg·L-1(T5)[廢水中的各種成分詳見1.1節(jié)，其中，(NH4)2SO4在T1～T5處理中的質(zhì)量濃度分別為1.65、2.12、2.83、3.54、4.24 g·L-1)，并用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)廢水初始pH值到8.00，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別向各個(gè)處理接種處于對(duì)數(shù)期的藻細(xì)胞，控制藻細(xì)胞質(zhì)量濃度在0.10 g·L-1左右(D690≈0.12)。每天對(duì)微藻生長情況和水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.2.2 曝二氧化碳?xì)怏w對(duì)微藻生長的影響

根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，當(dāng)廢水中的游離氨質(zhì)量濃度足夠低時(shí)(如1.0 mg·L-1)，其基本不會(huì)對(duì)微藻產(chǎn)生毒害作用。根據(jù)Yamamoto等[23]有關(guān)游離氨和氨氮質(zhì)量濃度、溫度及pH的計(jì)算公式，計(jì)算出30 ℃條件下含不同初始質(zhì)量濃度氨氮廢水中當(dāng)游離氨質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值。向含不同質(zhì)量濃度氨氮的廢水中通入二氧化碳?xì)怏w(流速為20 mL·min-1)，直至將其pH調(diào)至表1中指定值為止，曝氣過程結(jié)束。隨后向經(jīng)二氧化碳曝氣預(yù)處理的廢水中接種處于對(duì)數(shù)期的藻細(xì)胞，控制藻細(xì)胞質(zhì)量濃度在0.1 g·L-1左右(D690≈0.12)。每天對(duì)微藻生長情況和水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

表1 將各處理游離氨質(zhì)量濃度調(diào)至1.0mg·L-1時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值及二氧化碳曝氣時(shí)間

Table1Corresponding aeration time for regulating ammonia concentration to 1.0 mg·L-1of different treatments

處理Treatment初始氨氮質(zhì)量濃度Initial ammoniumconcentration/(mg·L-1)pH曝氣時(shí)間Aerationtime/minR13506.541.55R24506.252.33R36006.062.83R47505.923.77R59005.815.35

1.3 分析項(xiàng)目及方法

廢水中氨氮的質(zhì)量濃度采用納氏試劑法測(cè)定，廢水的pH值用pH計(jì)(HACH，PHS-3B型，美國)測(cè)定。微藻生物量采用分光光度法測(cè)定，在690 nm處測(cè)定D690，并按文獻(xiàn)[21]中的公式計(jì)算生物量。測(cè)定藻液吸光度時(shí)，以未接種微藻的模擬廢水作為對(duì)照，以扣除養(yǎng)豬廢水中懸浮物對(duì)藻液吸光度的影響。藻體氮含量參照測(cè)定植株全氮含量的相關(guān)方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度氨氮廢水中微藻的生長情況

近具刺鏈帶藻在5種質(zhì)量濃度的氨氮廢水中，生長均受到明顯抑制(圖1-A)。剛接種的微藻處于對(duì)數(shù)期，具有較強(qiáng)的活力，但由于廢水中氨氮質(zhì)量濃度過高，其生長受到抑制，因此生物量在2～5 d無明顯增加。隨著微藻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)及廢水中游離氨質(zhì)量濃度降低，微藻生物量從第6天起開始增加。除第1天外，T1處理下微藻的生物量始終顯著(P<0.05)高于其他處理。從第6天開始，微藻生物量隨著初始氨氮質(zhì)量濃度增加呈下降趨勢(shì)；到第7天時(shí)，各處理的微藻生物量由高到低依次為T1>T2>T3>T4>T5，且不同處理間差異顯著。

氨氮廢水中對(duì)微藻產(chǎn)生抑制作用的主要是游離氨[18]，它可以直接穿透細(xì)胞膜，對(duì)微藻光合系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用[18-19]。研究表明，當(dāng)游離氨的質(zhì)量濃度高于30.00 mg·L-1時(shí)，會(huì)對(duì)綠藻生長產(chǎn)生抑制作用[24]。微藻接種前，T1～T5處理的游離氨質(zhì)量濃度分別為32.91、49.59、67.88、83.44、101.82 mg·L-1(圖2-A)，均高于微藻生長的耐受閾值，因此各處理下微藻的生長均受到抑制。初始氨氮質(zhì)量濃度越低，廢水中的游離氨濃度越低，微藻生長受到的抑制程度越低，因此T1處理下微藻的生長情況好于其他處理。

相同時(shí)間柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters in the same time indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 微藻在不同質(zhì)量濃度氨氮廢水中的生長情況Fig.1 Growth of Desmodesmus sp. CHX1 in the wastewater with different ammonium concentrations

圖2 不同處理下廢水中的游離氨質(zhì)量濃度變化Fig.2 Variation of ammonia concentration in wastewater under different treatments

2.2 二氧化碳曝氣條件下微藻的生長情況

對(duì)含不同質(zhì)量濃度的氨氮廢水進(jìn)行曝二氧化碳?xì)怏w處理后，各處理廢水的pH值從8.00降至5.81～6.54，初始游離氨質(zhì)量濃度降至1.00 mg·L-1，明顯低于未曝氣處理(圖2)，因而微藻的生長情況也明顯優(yōu)于未曝氣處理(圖1)。培養(yǎng)7 d后，各處理的生物量增加0.32～0.47 g·L-1，較未曝氣處理提高0.09～0.26 g·L-1，且增加幅度隨廢水中初始氨氮質(zhì)量濃度升高而變大。與未曝氣相比，經(jīng)二氧化碳曝氣的各處理的微藻生物量有著相同的變化趨勢(shì)，即接種1 d后增長較快，隨后增長速度放緩。這是因?yàn)榈?天后廢水的pH值升高，導(dǎo)致游離氨濃度上升(圖2-B)，微藻生長受到抑制。此外，曝氣處理后微藻生物量隨初始氨氮質(zhì)量濃度增加而增加。這有可能是因?yàn)楫?dāng)曝氣處理將廢水中的游離氨質(zhì)量濃度限制在較低水平時(shí)，銨鹽質(zhì)量濃度越高，越有利于微藻的生長。為了證實(shí)這一推斷，將微藻生物量與氨氮質(zhì)量濃度進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，曝氣條件下二者呈顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系，即氨氮質(zhì)量濃度越高，微藻生物量越大；但未曝氣條件下微藻生物量與氨氮質(zhì)量濃度則呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3)。由此可見，二氧化碳曝氣預(yù)處理可以改善微藻在高質(zhì)量濃度氨氮廢水中的生長情況。原因是：一方面，曝二氧化碳?xì)怏w降低了廢水的pH值，使得游離氨的質(zhì)量濃度降低；另一方面，曝二氧化碳?xì)怏w增加了廢水中的碳源供給，有助于提高微藻的生物量[25]。

2.3 不同處理下廢水的pH值變化

圖3 曝氣與未曝氣條件下微藻生物量與氨氮質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.3 Relationship between microalgae biomass and ammonium concentration under both with or without aeration conditions

2.4 不同處理廢水中的氨氮去除率

對(duì)微藻培養(yǎng)過程中各處理的氨氮質(zhì)量濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，各處理的氨氮質(zhì)量濃度均呈緩慢下降趨勢(shì)。培養(yǎng)7 d后，各處理的氨氮去除率在3.76%～20.10%(表2)，以R1處理最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理。各處理的氨氮去除速率在3.52～25.48 mg·L-1·d-1，以T5處理最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理。對(duì)比可見，當(dāng)廢水中的初始氨氮質(zhì)量濃度<600 mg·L-1時(shí)，曝氣處理的氨氮去除效率顯著(P<0.05)高于未曝氣處理；但當(dāng)廢水中的初始氨氮質(zhì)量濃度≥600 mg·L-1時(shí)，曝氣處理的氨氮去除效果并不優(yōu)于未曝氣處理。廢水中的氨氮主要通過氨揮發(fā)和微藻吸收等形式被去除[28]，其中，微藻吸收僅占氨氮去除的很小一部分，廢水中的氨氮主要通過氨揮發(fā)等途徑得以去除，該部分所占比例高達(dá)99%以上。該結(jié)果與前人研究一致[29]。

3 結(jié)論

近具刺鏈帶藻在初始氨氮質(zhì)量濃度為350～900 mg L-1的廢水中生長受到明顯抑制。向廢水中曝二氧化碳?xì)怏w可以降低廢水pH值，從而減少廢水中的游離氨對(duì)微藻生長的抑制。在未曝二氧化碳?xì)怏w的情況下，若利用氨氮作為唯一氮源培養(yǎng)微藻，廢水中的pH值下降；而曝氣處理下，廢水中的pH值呈先升高后降低趨勢(shì)。在本試驗(yàn)條件下，廢水中氨氮的去除率在3.76%～20.10%。

R1～R5處理第1天的pH值見表1，因均低于7.0，故在圖中未給出。The pH values of R1-R5 (seen in Table 1) were smaller than 7.0， so they were not shown in the above figure.圖4 不同條件下各處理的廢水pH值變化Fig.4 Variation of pH in the wastewater under different treatments

表2 廢水中氨氮的去除情況與途徑

Table2Removal efficiency and ways of ammonium in wastewater

處理Treatment去除率Removalefficiency/%去除速率Removal rate/(mg·L-1·d-1)各途徑的去除比例Contribution of different removal ways/%微藻吸收Assimilation by microalgae氨損失Ammonia lossT117.37±0.28 b10.13±0.19 d0.00399.997T24.69±0.54 e3.52±0.46 e0.01499.986T34.55±0.16 e4.55±0.43 e0.00599.995T49.92±0.26 d12.40±0.32 c0.00499.996T516.98±1.50 b25.48±2.25 a0.00299.998R120.10±0.56 a11.72±0.96 cd0.01499.986R214.69±0.64 c11.01±0.48 cd0.00799.993R33.76±0.31 e3.76±0.57 e0.04199.959R48.76±0.06 d10.98±0.08 cd0.01199.989R510.02±0.11 d15.03±0.16 b0.01699.984

同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05.