董宇飛，呂相漳，張自坤，賀洪軍，喻景權(quán)，周艷虹，*

(1.浙江大學(xué) 園藝系，浙江省園藝作物整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2.德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 德州 253015)

土壤連作會(huì)造成土壤養(yǎng)分不均衡，土壤肥力降低，植株根系活力下降，植株長(zhǎng)勢(shì)變差[1]。據(jù)調(diào)查，隨著辣椒種植面積的擴(kuò)大和連作年限的增加，連作障礙日益嚴(yán)重，輕者減產(chǎn)30%左右，嚴(yán)重的減產(chǎn)60%以上，甚至絕產(chǎn)[2]。連作障礙發(fā)生的原因很多，其主要原因是連續(xù)單一種植同一作物導(dǎo)致作物根際微生態(tài)平衡失調(diào)、微生物種群結(jié)構(gòu)失衡、微生物總數(shù)和土壤酶活性下降[3]。因此，采用合理的耕作制度，如不同作物合理輪作、適當(dāng)作物間作等措施，是提高土壤質(zhì)量及作物產(chǎn)量的重要手段。

眾多研究表明，輪間作系統(tǒng)通過(guò)維持土壤微生物群落的多樣性和活動(dòng)，抑制單一栽培中的有害微生物而增加有益微生物活性和數(shù)量，提高土壤酶活性來(lái)提高作物產(chǎn)量[4-6]。比如，西瓜與水稻水旱輪作的模式，減少了土壤中的根結(jié)線蟲，降低了西瓜枯萎病及水稻紋枯病發(fā)病率，改善了土壤的微生態(tài)系統(tǒng)[7]；大蒜與油菜間作減輕大蒜白腐病發(fā)生[8]；Khan等[9]采用胡椒間作大蒜通過(guò)改變酶活性和土壤微生物種群來(lái)提高土壤肥力。栽培方式不同，對(duì)土壤肥力和質(zhì)量提升程度不同，導(dǎo)致土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量、微生物種類和土壤酶活性也不同，而這些差異又會(huì)對(duì)土壤生理生化性質(zhì)及生產(chǎn)力產(chǎn)生重要影響，因此，土壤微生物生物量和酶活性等特性可以作為衡量土壤質(zhì)量的生物指標(biāo)[10]。

在辣椒生產(chǎn)中，輪作或者間作有利于緩解連作障礙進(jìn)而提高辣椒產(chǎn)量這一點(diǎn)早已廣為人知并得以應(yīng)用，但對(duì)于輪作和間作有利的原因，尤其是其土壤微生物學(xué)機(jī)制尚未明確。因此，本研究主要從土壤微生物和酶活性方面探討輪間作模式對(duì)于辣椒連作障礙的影響，分析不同栽培模式辣椒土壤微生物結(jié)構(gòu)和群落多樣性差異，以及輪間作處理對(duì)連作辣椒土壤酶活性的影響，以期為克服辣椒連作障礙提供理論依據(jù)，并且提供一定的實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試土壤樣品取自山東省德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，試驗(yàn)在同一地區(qū)相鄰地塊共設(shè)9個(gè)小區(qū)，進(jìn)行連作3年辣椒、玉米-辣椒間作3年、大蒜-辣椒輪作3年3個(gè)處理，每個(gè)處理各隨機(jī)占3個(gè)小區(qū)，小區(qū)之間由挑溝進(jìn)行分隔，供試?yán)苯菲贩N為德紅2號(hào)。在進(jìn)行該試驗(yàn)之前，各處理土壤化學(xué)特征相似：土壤pH值為7.96±0.05，EC值為(773±11)μS·cm-1，有機(jī)質(zhì)含量為(11.712±0.857)g·kg-1。試驗(yàn)地區(qū)50%以上為潮土類，堿解氮含量屬中等水平，速效磷含量較高，速效鉀含量一般，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民常規(guī)栽培管理。土壤樣品的采集于2017年8月末辣椒成熟期進(jìn)行。在每個(gè)處理小區(qū)按五點(diǎn)取樣法隨機(jī)取樣，即選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻并具有代表性的5株辣椒，用直徑約5 cm的土鉆取距辣椒植株約5 cm處、0～20 cm深的根際土樣作為一個(gè)樣品，混勻并挑除雜質(zhì)放入取樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室。之后一部分于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏用于稀釋平板法測(cè)可培養(yǎng)微生物數(shù)量；一部分置于陰涼處風(fēng)干，過(guò)2 mm篩用于土壤酶活性的測(cè)定；另一部分樣品裝在滅過(guò)菌的50 mL離心管內(nèi)置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍保存，用于高通量測(cè)序分析微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 土壤微生物數(shù)量測(cè)定

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物檢測(cè)[11]，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇10-4、10-5、10-6倍稀釋度懸液涂平板，每個(gè)稀釋度均做3個(gè)重復(fù)，在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)；真菌培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基，選擇10-1、10-2和10-3倍稀釋度懸液涂平板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，在28 ℃條件下倒置培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)；放線菌培養(yǎng)采用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，選擇10-3、10-4和10-5倍稀釋度懸液涂平板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，在30 ℃條件下倒置培養(yǎng)5～7 d后計(jì)數(shù)，并計(jì)算土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量的比值(B/F)，以反映土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)；B/F比值降低，導(dǎo)致土壤土傳病害發(fā)生嚴(yán)重[12-13]。

1.2.2 土壤酶活性的測(cè)定

土壤過(guò)氧化氫酶和土壤脲酶活性分別采用Solarbio公司土壤過(guò)氧化氫(S-CAT)檢測(cè)試劑盒和Solarbio公司土壤脲酶(S-UE)檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.2.3 土壤微生物高通量測(cè)序

土壤微生物分析采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput sequencing)，這一技術(shù)又稱二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)或者平行測(cè)序(parallel sequencing)，可直接測(cè)序16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物，每次分析獲得的基因序列數(shù)以百萬(wàn)甚至億萬(wàn)計(jì)，不僅通量高，而且能夠同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品，是解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對(duì)豐度的重要工具，已經(jīng)成為環(huán)境微生物多樣性檢測(cè)的首選[14-15]。Shannon-winner曲線是利用Shannon指數(shù)來(lái)進(jìn)行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。

土壤微生物DNA提取采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒，分別用真菌和細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物具體信息如表1所示，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收檢測(cè)濃度后保存于-20 ℃用于后續(xù)的高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪間作處理對(duì)辣椒根際連作土壤微生物數(shù)量的影響

如表2所示，測(cè)試土壤中微生物群落中可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量最多，其次是放線菌，真菌數(shù)量最少，而且不同種植模式對(duì)土壤三大類群微生物數(shù)量有顯著的影響。不同種植模式土壤細(xì)菌數(shù)量變化為間作>輪作>連作；土壤真菌數(shù)量變化為連作>間作>輪作；土壤放線菌數(shù)量變化為輪作>間作>連作。與連作辣椒模式相比，大蒜-辣椒輪作以及玉米-辣椒間作能夠明顯增加土壤細(xì)菌數(shù)量，增幅分別為88.24%、112.61%；土壤放線菌數(shù)量分別增加302.81%、156.25%；土壤真菌數(shù)量分別減少51.74%、39.57%，差異達(dá)到顯著(P<0.05)水平。

此外，大蒜-辣椒輪作土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量的比值(B/F)最大，玉米-辣椒間作土壤次之，連作辣椒土壤最小，說(shuō)明輪作和間作處理均能促進(jìn)土壤細(xì)菌增殖而抑制真菌增殖，B/F值升高。以上結(jié)果表明，采用大蒜輪作和玉米間作能夠有效改善辣椒根際微生物區(qū)系，使根際微生物組成由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變。

表1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Table1Primers used for PCR amplification

表2 不同種植模式土壤三大類群微生物數(shù)量變化

Table2Dynamic of three major microbial number of different planting patterns

同列數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same column followed by different letters showed significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 輪間作處理對(duì)連作辣椒根際土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 輪間作處理對(duì)連作辣椒根際土壤微生物多樣性的影響

從表3的微生物多樣性Shannon指數(shù)中可以看出，各處理土壤細(xì)菌和真菌Shannon指數(shù)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。與連作土壤相比，輪作和間作處理能夠顯著增加土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)，增幅分別為6.84%、5.63%；同時(shí)分別顯著降低土壤真菌群落Shannon指數(shù)，降幅分別為13.06%、5.23%。

2.2.2 輪間作處理對(duì)辣椒根際連作土壤微生物群落組成的影響

如圖1所示，所有樣品中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌按照其相對(duì)豐度的高低依次為(α-，β-，γ-，δ-)變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidete)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其中(α-，β-，γ-，δ-)變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)為優(yōu)勢(shì)種群，所有樣品中它們相對(duì)豐度分別為32%、23%；此外，所有樣品中真菌相對(duì)豐度從高到低依次為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)，其中子囊菌門(Ascomycota)為優(yōu)勢(shì)種群，占所有可測(cè)真菌群落的59%，是供試土壤樣品中主要的真菌類群。

表3 不同處理土壤細(xì)菌和真菌Shannon指數(shù)

Table3Shannon index of soil bacteria and fungi of different treatments

處理Treatment群落多樣性(Shannon指數(shù))Shannon index細(xì)菌Bacteria真菌Fungi間作Intercropping12.296±0.057 b7.044±0.011 b輪作Rotation12.437±0.058 a6.462±0.012 c連作Continuous cropping11.641±0.050 c7.433±0.008 a

如圖2-A所示，不同處理土壤細(xì)菌群落中酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidete)、浮霉菌門(Planctomycetes)、黃單孢菌目(Xanthomonada)相對(duì)豐度差異較大。與連作3年相比，輪作和間作處理顯著提高了土壤酸桿菌門(Acidobacteria)的相對(duì)豐度，增幅為27.91%、39.42%；同時(shí)提高了浮霉菌門(Planctomycetes)的相對(duì)豐度，增幅為61.22%、51.63%；但顯著降低了擬桿菌門(Bacteroidete)和黃單孢菌目(Xanthomonada)的相對(duì)豐度，以輪作處理效果最為顯著，降幅分別為71.78%、47.86%。圖2-B是不同處理土壤中相對(duì)豐度差異顯著(P<0.05)的三類真菌，雖然子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和接合菌門(Zygomycota)相對(duì)豐度較低，但在不同處理土壤中相對(duì)豐度差異顯著。與連作3年土壤相比，輪間作處理顯著降低了子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，其中子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)的相對(duì)豐度分別減少56.36%、81.81%，鐮刀菌屬(Fusarium)的相對(duì)豐度分別減少46.77%、36.62%，但接合菌門(Zygomycota)相對(duì)豐度顯著增多，分別增加433.33%、283.33%。

由每個(gè)分類群條帶總數(shù)占測(cè)序條帶總數(shù)的比例繪制而成。The figure was drawn according to the percentage of number of each taxon bands in the total number of sequencing bands.圖1 細(xì)菌(A)和真菌(B)分類群組成Fig.1 Bacteria (A) and fungi (B) taxonomic group

同一種類不同處理間沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars in the same type with different letters showed significant difference(P<0.05).圖2 不同處理土壤細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度差異Fig.2 Differences between soil bacteria and fungi abundance of different treatments

2.3 輪間作處理對(duì)辣椒根際連作土壤酶活性的影響

如圖3所示，與連作土壤相比，玉米-辣椒間作和大蒜-辣椒輪作明顯增加了土壤過(guò)氧化氫酶活性，增幅分別為109.92%、122.31%，此外，輪間作處理也顯著提高了土壤脲酶活性，增幅分別為129.34%、93.67%，以輪作效果更為明顯，差異達(dá)到顯著(P<0.05)水平。

不同處理間沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars with different letters showed significant difference(P<0.05).圖3 不同處理土壤過(guò)氧化氫酶和脲酶活性Fig.3 Soil catalase and urease activity of different treatments

3 討論

大量研究表明，許多作物連作會(huì)導(dǎo)致土壤理化性狀變差、養(yǎng)分失衡等問(wèn)題，而采用嫁接、施用微生物菌劑，以及合理的輪作、間作、填閑等栽培模式能夠提高土壤微生物種群多樣性和穩(wěn)定性，緩解連作障礙，促進(jìn)作物生長(zhǎng)、增加產(chǎn)量。段曦等[16]采用嫁接的方式發(fā)現(xiàn)，嫁接辣椒根系分泌物組分變化是其減輕土傳病害的重要機(jī)理之一，砧木和嫁接辣椒降低辣椒發(fā)病率，產(chǎn)量分別比對(duì)照高31.7%和38.3%。祁紅英等[17]進(jìn)行了幾種微生物菌劑對(duì)辣椒混合性土傳病害的田間防效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)微生物菌劑AR156-2處理增產(chǎn)率達(dá)214.39%。本研究采用輪作和間作等不同的栽培模式發(fā)現(xiàn)，大蒜-辣椒輪作和玉米-辣椒間作均顯著改善了連作辣椒土壤微生物區(qū)系和土壤酶活性，但其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物是土壤重要的組成部分，參與土壤中物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，對(duì)土壤肥力的形成及其在植物營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化中起著積極的作用。土壤微生物群落的多樣性和豐富度都與其生態(tài)環(huán)境相關(guān)[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，大蒜-辣椒輪作和玉米-辣椒間作處理后辣椒土壤微生物群落數(shù)量發(fā)生了顯著變化，輪間作處理較連作土壤細(xì)菌顯著增多，增幅分別為88.24%、112.61%，與此同時(shí)土壤放線菌數(shù)量增幅為302.81%、156.25%，真菌數(shù)量顯著減少51.74%、39.57%(表2)。楊鳳娟等[19]在黃瓜上的研究也得出了類似結(jié)果。高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，與連作土壤相比，輪間作處理細(xì)菌群落多樣性顯著增加，真菌相反(表3)。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是輪間作處理使土壤微生態(tài)環(huán)境及其可利用的營(yíng)養(yǎng)發(fā)生了變化，從而使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。以上結(jié)果表明，輪間作處理使連作辣椒土壤微生物群落結(jié)構(gòu)由“真菌型”向“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變。我們推測(cè)這種變化可能與輪間作處理改善了土壤微生態(tài)環(huán)境和土壤營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)。

土壤微生物中細(xì)菌和真菌的種類和數(shù)量最多，其群落結(jié)構(gòu)的改變與作物種類、土壤類型和養(yǎng)分、作物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期等密切相關(guān)。在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面，已有研究表明，相比于馬鈴薯感病型土壤，酸桿菌門在抑病型土壤中豐度較高[20]；Sanguin等[21]在連續(xù)種植了10年小麥的抑病型土壤中發(fā)現(xiàn)很多屬于酸桿菌門、浮霉菌門的種群急劇增加，并指出這幾個(gè)門與土壤抑病功能密切相關(guān)；擬桿菌的分布與土壤營(yíng)養(yǎng)水平呈顯著負(fù)相關(guān)[22]；黃單孢菌目部分細(xì)菌是植物病原菌，能夠引起辣椒細(xì)菌性瘡痂病。本實(shí)驗(yàn)中，輪間作處理較連作土壤擬桿菌門(Bacteroidete)比例顯著降低，可能是與輪間作處理改善了土壤營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)。此外，酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)相對(duì)豐度顯著升高，而黃單孢菌目(Xanthomonada)相對(duì)豐度顯著下降(圖2)，推測(cè)這可能是輪間作處理可以緩解辣椒土傳病害而連作土壤易發(fā)病的原因之一。在真菌群落結(jié)構(gòu)方面，已有報(bào)道表明，作物土傳枯萎病病原菌的相對(duì)豐度與真菌接合菌門呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，和真菌子囊菌門呈正相關(guān)關(guān)系[23]；許多病原菌均屬于子囊菌門，部分鐮刀菌屬是土壤根際潛在病原菌，可侵染植物維管束系統(tǒng)，破壞作物輸導(dǎo)組織維管束，導(dǎo)致作物萎蔫死亡；與甜瓜連作根際土壤相比，茴香輪作根際土壤中鐮刀菌屬略有下降趨勢(shì)[24]；引起果實(shí)煤污病的大多數(shù)病原菌屬于座囊菌綱[25-26]。本實(shí)驗(yàn)中，輪間作處理土壤真菌的接合菌門(Zygomycota)相對(duì)豐度較連作土壤顯著升高，可能是由于接合菌能夠與高等植物共生形成菌根從而改良土壤微生態(tài)環(huán)境。此外，我們還發(fā)現(xiàn)輪間作處理較連作土壤子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和鐮刀菌屬(Fusarium)相對(duì)豐度顯著降低，推測(cè)輪間作處理緩解連作障礙的原因可能與抑制此類病原菌的發(fā)生有關(guān)。

土壤酶參與有機(jī)質(zhì)的分解和腐殖質(zhì)的形成，是土壤生物活性的綜合表現(xiàn)，其催化土壤中的生物化學(xué)反應(yīng)，影響土壤養(yǎng)分的形成和積累[27-28]。其中，過(guò)氧化氫酶主要來(lái)源于細(xì)菌、真菌以及植物根系的分泌物，它能破壞土壤中生化反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫，將過(guò)氧化氫分解為水和氧，減輕活性氧對(duì)植物的危害[29]。脲酶是一種對(duì)土壤有機(jī)態(tài)氮分解轉(zhuǎn)化起非常重要作用的酶，它直接參與尿素形態(tài)轉(zhuǎn)化，能夠催化尿素水解生成氨、水和二氧化碳，可以作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)，其活性反映土壤有機(jī)態(tài)氮向有效態(tài)氮的轉(zhuǎn)化能力和土壤無(wú)機(jī)氮的供應(yīng)能力[30]。在本實(shí)驗(yàn)中，與連作土壤相比，大蒜-辣椒輪作處理和玉米-辣椒間作處理之后，土壤過(guò)氧化氫酶活性和脲酶活性顯著升高(圖3)，推測(cè)輪間作栽培方式可能通過(guò)提高土壤過(guò)氧化氫酶和脲酶活性，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步提高土壤供氮能力，改善因連作導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)惡化的現(xiàn)象。這一結(jié)果與吳鳳芝等[5]和楊鳳娟等[19]在黃瓜設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中輪間作能夠提高土壤過(guò)氧化氫酶、脲酶及相關(guān)酶活性的結(jié)果一致。

綜上所述，輪間作處理可能通過(guò)提高土壤酶活性、改善辣椒土壤微生物區(qū)系進(jìn)而使得連作辣椒根際土壤得到一定程度的改良，但本實(shí)驗(yàn)未直接測(cè)定輪間作處理對(duì)土壤理化性質(zhì)和辣椒生長(zhǎng)發(fā)育的影響，因此，輪間作處理緩解辣椒連作障礙的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。