易可可，陰文奇，周遠(yuǎn)成，蔣金蓁，張白玉，李中銀，顏其貴，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；3.四川華神獸用生物制品有限公司，四川 成都 610200；4.四川伊禾動物藥品有限公司，四川 成都 610066)

豬偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)引起的一種由皰疹病毒感染的高度接觸性傳染病[1-2]，能引起豬發(fā)熱、奇癢、繁殖障礙、腦脊髓炎等癥狀。PRV能感染反芻動物、嚙齒動物、食肉動物等哺乳動物和鳥類，有高致病率[3-5]，但豬是PRV唯一的傳播和貯存宿主[6]，能隱性感染，長期帶毒，曾經(jīng)給歐洲和美洲帶來巨大經(jīng)濟(jì)影響[7-10]。PRV主要侵害豬神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，各個(gè)階段豬只均可感染，可引起妊娠母豬繁殖障礙病毒終身潛伏、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和呼吸道癥狀；新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉、嘔吐、生長不良等表現(xiàn)，死亡率極高[11]，一旦感染該病，難以清除[12]，其傳播速度快、范圍廣、途徑多，國際動物衛(wèi)生組織(OIE)已將其列為二類傳染病[6]。20世紀(jì)gE基因缺失的Bartha-K61疫苗傳入中國，從90年代開始廣泛應(yīng)用于我國的各大豬場，使PRV得到了有效的控制[13]。2011年以來，許多接種了Bartha-K61疫苗的豬場大規(guī)模暴發(fā)PRV，對我國養(yǎng)豬業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失，通過近年來的分離毒株分析，PRV變異是暴發(fā)偽狂犬病的最主要原因[14-15]。由此可見，Bartha-K61疫苗不能對變異PRV毒株起到全面和有效保護(hù)作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)從2016—2017年疑似感染偽狂犬病的豬病料中分離出4株P(guān)RV毒株，通過生物學(xué)特性研究分析，并收集2011年至今的主要變異毒株和國內(nèi)外經(jīng)典毒株進(jìn)行毒力基因gB、gC、gE和TK序列比對，進(jìn)行同源性測定并構(gòu)建進(jìn)化樹，分析變異株的基因間差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與實(shí)驗(yàn)動物

從福建和四川某豬場疑似PRV感染仔豬中分別采集腦、扁桃體、肺臟、脾臟等組織，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?周齡Balb/c小白鼠購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.2 主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自AusGeneX公司；LATaq聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、GC Buffer、dNTP、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程(大連)有限公司；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；豬腎細(xì)胞(PK-15細(xì)胞)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 病豬的病理解剖與病料處理

對采集的病豬病變組織進(jìn)行研磨，加入適量PBS制成勻漿，反復(fù)凍融3次，10 000g離心5 min，將上清液分裝置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRVgB、gC、gE、TK(登錄號為KM189912.1)全基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)gE檢測引物和4對引物擴(kuò)增該4個(gè)基因的全長，引物序列見表1，引物由成都擎科有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取

對采集的組織病料提取DNA，使用TIANGEN的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.4 病料PCR鑒定

以提取的病料DNA作為模板，反應(yīng)體系為25 μL，LATaq酶0.25 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dNTP 1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足25 μL。鑒定PRVgE基因反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，61.4 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，溫度降至4 ℃，加入2.5 μL 10×Loading Buffer終止反應(yīng)；取10.0 μL PCR產(chǎn)物加入1.0%瓊脂糖膠孔中電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。

表1 引物序列信息

Table1Primer sequence information

引物名稱Primer name引物序列Sequence(5′-3′)長度Length/bp退火溫度Annealing temperature/℃GC Buffer引物用途UsagePgE-FACCTGAGCGTCCTGCGG55361.4Buffer Ⅰ鑒定PRV Identification of PRVPgE-RCCGTTGTGGGTCATCACGAGgB-FTCTTCAGGTCCGTCTTCCAC287751.0Buffer ⅡgB基因 gB genegB-RAACGGCATCTTTATTTTTTTCCATCTgC-FTGTGTGCCACTAGCATTAAATCCG170255.0Buffer ⅠgC基因gC genegC-RGAGAGGAGAGTGGAGTGGGACgE-FGCCACCATCGCAGAAGAACAA205756.0Buffer ⅡgE基因gE genegE-RTCTCGCTGTAGTAGCAGTCCGTK-FATGCGCATCCTCCGGATCTACCTCG96362.0Buffer ⅠTK基因TK geneTK-RTCACACCCCCATCTCCGACGTGAAG

1.2.5 病毒分離培養(yǎng)

將PCR鑒定為陽性的PRV病料處理成懸液，4 ℃ 4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm過濾器過濾后，加適量雙抗孵育過夜，保存至-20 ℃。待PK-15細(xì)胞長成單層鋪至80%時(shí)，取1 mL濾液接種細(xì)胞，輕輕混勻，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中放置1 h，倒去濾液加入2% DMEM維持液，同時(shí)設(shè)立對照細(xì)胞組，每天觀察細(xì)胞狀況，并記錄病變情況，待病變達(dá)到70%時(shí)收毒，盲傳5代后進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 病毒TCID50測定

將收集的病毒液反復(fù)凍融3次，12 000 r·min-1離心1 min，取上清液。PK-15細(xì)胞在96孔中培養(yǎng)至單層，將分離的病毒液用DMEM培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋，從10-1～10-10，按照每個(gè)稀釋度分別加1列8孔，每孔加入100 μL，最后兩列只加入DMEM培養(yǎng)液作陰性對照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱放1 h后吸去每孔中的液體，用PBS洗兩次后加入100 μL 2% DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后開始觀察并每天記錄病變孔數(shù)情況，按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.7 小鼠LD50測定

每株準(zhǔn)備50只6周齡雌性SPF級Balb/c小鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只。將病毒10倍梯度稀釋成104～100TCID50s，每個(gè)稀釋度一組，接種0.1 mL于小鼠大腿肌肉；同時(shí)設(shè)立一組空白對照，相同劑量和部位注射DMEM培養(yǎng)液，在相同條件下隔離飼養(yǎng)。每6 h觀察并記錄小鼠精神狀況、臨床癥狀和死亡時(shí)間，結(jié)果根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒對Balb/c小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。

1.2.8gB、gC、gE和TK全基因測序

病毒液抽提DNA后作為模板，反應(yīng)體系為50 μL，LATaq酶0.5 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 25 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL，dNTP 4 μL(根據(jù)目的條帶長度添加，每1 000 bp添加1 μL)，滅菌去離子水補(bǔ)足50 μL。94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，51 ℃(根據(jù)不同引物選擇退火溫度)1 min，72 ℃ 1 min(根據(jù)目的條帶大小選擇，每1 000 bp延長1 min)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，溫度降至4 ℃，PCR產(chǎn)物加入1.0%瓊脂糖膠孔中電泳，回收目的片段，連接pMD18-T載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB氨芐固體培養(yǎng)基上篩選出陽性菌后，提取質(zhì)粒，送往成都擎科生物有限公司測序。

1.2.9 毒力基因全基因序列分析

參考多株國內(nèi)外經(jīng)典和變異PRV毒株，利用Mega7.0和MegAlign軟件將測序結(jié)果的gB、gC、gE和TK基因序列進(jìn)行對比和建立進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV的分離鑒定

2.1.1 病理剖檢結(jié)果

患病仔豬剖檢后發(fā)現(xiàn)所有仔豬均出現(xiàn)腦出血，扁桃體壞死，肺臟和腎臟有出血點(diǎn)，肝臟和肺臟表面有白色壞死灶等癥狀。

2.1.2 病料檢測結(jié)果

病料組織進(jìn)行g(shù)E基因PCR擴(kuò)增后，在檢測的腦部、扁桃體、腎臟、肺臟等均擴(kuò)增出553 bp的目的條帶。

2.1.3 病毒的分離

處理的組織懸液接種到長滿單層的PK-15細(xì)胞上，第1代均出現(xiàn)病變，盲傳幾代后時(shí)間和CPE穩(wěn)定，接毒后24 h后細(xì)胞變圓變亮，聚集，拉網(wǎng)并形成合胞體(圖1-A)，而對照組沒有病變(圖1-B)。

2.1.4 病毒液的PCR鑒定

對病毒液提取的核酸進(jìn)行PRVgEPCR鑒定，結(jié)果能擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。

2.1.5 病毒滴度測定

病毒在PK-15細(xì)胞上傳第1代和第5代的都收毒進(jìn)行滴度測定，按照Reed-Muench法計(jì)算PRV的滴度，單位為每0.1 mL病毒液中含多少TCID50s的病毒粒子，結(jié)果如表2。

2.1.6 小鼠LD50測定

PRV FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株分別攻毒Balb/c小鼠后，臨床癥狀為局部嚴(yán)重瘙癢、呼吸急促、被毛蓬亂、頻繁舔咬注射部位并裸露出皮膚，死亡時(shí)間平均為54～96 h，高劑量小鼠全部死亡，對照組小鼠精神狀態(tài)正常。PRV各毒株對Balb/c小鼠的半數(shù)致死量LD50分別為102.17、102.72、103.44、103.51TCID50s(表3)。

A，PRV感染細(xì)胞；B，正常細(xì)胞對照。A， Virus infected cell; B， Normal cell control.圖1 病料懸液上清液感染PK-15細(xì)胞病變圖(100×)Fig.1 Cytopathic effect of PK-15 cells infected by epidemic tissue suspension supernatant (100×)

表2 不同代次PRV毒株滴度測定

Table2Titers identification of different passage PRV strains

毒株Strain滴度Titers/(TCID50s·0.1 mL-1)F1F5FJ0110-6.310-6.63FJ0310-6.610-7.08YK10-7.710-8.10MS201810-6.710-7.18

2.2 PRV分離株的gB、gC、gE和TK基因的序列分析

2.2.1gB基因

PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株的gB基因核苷酸序列與2011年以來國內(nèi)流行的PRV變異株HNB、ZJ01、JS-2012、TJ株等的同源性為98.5%～100%，與疫苗株Ea、Fa和Bartha株同源性為98.2%～99.8%，與國內(nèi)外PRV經(jīng)典毒株Kaplan、Kolchis、NIA3、Becker等同源性為97.7%～99.6%；4個(gè)分離PRV毒株的gB基因編碼的氨基酸與近年流行的變異株同源性為97.0%～100%，與疫苗株同源性為96.3%～99.7%，與經(jīng)典毒株同源性為95.3%～99.1%。PRV FJ01、FJ03和MS2018株在進(jìn)化樹上與近幾年國內(nèi)分離的PRV變異株HN1201、HNX、HNB等在同一大分支；YK株與國外經(jīng)典毒株親緣性更近(圖3-A)。

表3PRV毒株對Bablb/c小鼠LD50測定

Table3LD50measurement of PRV strains on Balb/c mice

毒株Strain分組Group感染劑量Dose/TCID50s小鼠數(shù)量Mice number死亡數(shù)Mortality存活數(shù)Survival number半數(shù)致死量LD50/TCID50sFJ01A410410100102.17A310310100A21021046A110110010A010010010FJ03B41041091102.72B31031073B21021019B110110010B010010010MS2018C41041073103.51C31031028C21021019C110110010C010010010YKD41041082103.44D31031028D21021019D110110010D010010010對照組ControlEPK1510010—

“—”表示無數(shù)據(jù)。

“—” represented no data.

圖3 PRV分離株gB、gC基因的核苷酸遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PRV gB and gC gene between PRV strains and other reference strains

2.2.2gC基因

PRV FJ01株、FJ03株和MS2018株gC基因的核苷酸序列與近年流行變異PRV株同源性為91.8%～99.9%，與Ea、Fa、Bartha和SA215疫苗株同源性為91.9%～99.9%，與國內(nèi)外經(jīng)典毒株同源性為89.3%～98.7%，同源性較低；gC基因編碼的氨基酸與變異毒株，除YK株外同源性為97.0%～100%，YK株為89.5%～89.7%，同源性較低；與PRV疫苗株同源性為88.4%～99.4%，與國內(nèi)外經(jīng)典毒株同源性為86.0%～96.9%。在進(jìn)化分支上，PRV FJ01株、FJ03株、MS2018株與國內(nèi)毒株親緣性更近，與近年的變異株在同一大進(jìn)化分支上，而YK株與國外經(jīng)典毒株在同一進(jìn)化分支上，與國內(nèi)毒株親緣性遠(yuǎn)(圖3-B)。

2.2.3gE基因

PRV FJ01株、F0J3株和MS2018株gE基因的核苷酸序列與近年流行變異PRV株同源性為95.9%～99.5%，與Ea、Fa、Bartha疫苗株的同源性為96.4%～99.5%，與Kaplan、Becker、Kolchis、Hercules等國外經(jīng)典毒株同源性為96.1%～98.8%；gE基因編碼的氨基酸與近年變異PRV株同源性為90.6%～100%；與疫苗毒株同源性為95.8%～99.4%，與國外經(jīng)典毒株同源性為95.6%～100%。FJ01株、FJ03株、MS2018株在進(jìn)化樹上與國內(nèi)2011年后分離出的PRV毒株如HNX株、HLJ8株、HB1201株、HN1201株等在同一大進(jìn)化分支上，與疫苗毒株和國內(nèi)外經(jīng)典毒株親緣性較遠(yuǎn)；YK株與國外經(jīng)典毒株在同一進(jìn)化分支上，親緣性較近(圖4-A)。

2.2.4TK基因

4個(gè)分離PRV毒株的TK基因核苷酸序列與國內(nèi)近幾年流行分離HNX、JS-1201、HB1201、BJ/YT等變異毒株同源性為98.4%～100%，與Bartha、Fa、Ea等疫苗株同源性為98.6%～100%，與國外經(jīng)典毒株Kaplan、Becker等同源性在97.9%～99.7%，各毒株間遺傳變異不大，同源性都很高，說明TK基因較為保守。TK編碼的氨基酸序列與近年變異株同源性為99.7%～100%，與疫苗株同源性為99.0%～99.9%，與國外經(jīng)典毒株同源性為98.3%～99.9%，同源性較高。FJ01株、FJ03株與MS2018株的TK基因序列在進(jìn)化樹上與國內(nèi)分離的各PRV毒株在同一進(jìn)化分支上，與國內(nèi)毒株親緣性較近；YK株的TK基因與國內(nèi)和國外均親緣性較遠(yuǎn)，在單獨(dú)一個(gè)分支上(圖4-B)。

3 討論

自2011年以來，中國許多地區(qū)免疫過Bartha-K61疫苗的豬場大規(guī)模暴發(fā)PRV[17]，且在國內(nèi)廣泛流行，有研究已經(jīng)確定了是由PRV變異毒株引起[18]，意味著Bartha-K61疫苗已不能全面提供保護(hù)[19]，疑似暴發(fā)PRV豬場的豬表現(xiàn)為高燒、嚴(yán)重呼吸道疾病、厭食、震顫等精神癥狀[18]。本研究對各地豬場有疑似PRV的病料進(jìn)行抗原檢測和病毒分離，得到4株P(guān)RV病毒，初步鑒定為野毒感染，并深入研究是否為變異毒株以及生物學(xué)特性探究。

圖4 PRV分離株gE、TK基因的核苷酸遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PRV gE and TK gene between PRV strains and other reference strains

本實(shí)驗(yàn)采用豬腎PK-15細(xì)胞分離病毒，4個(gè)病毒分別命名為PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株。將病毒盲傳至5代，同時(shí)與第一代病毒做TCID50，發(fā)現(xiàn)滴度隨著代數(shù)增多而增加。用第5代毒攻毒Balb/c小鼠計(jì)算半數(shù)致死量，毒力最強(qiáng)的毒株為PRV FJ01株，LD50為102.17TCID50s·0.1mL-1，而我國在2011年前就分離得到的Fa、Ea和S經(jīng)典毒株LD50分別是100.7、102.0和103.83TCID50s，2011年后分離出的HNX、HNB、TJ、HeN1和JS-2012株的LD50分別為102.0、102.4、102.3、102.37和102.37TCID50s，可以看出Fa毒力是最高的，由此可以得知，中國變異株的毒力沒有增強(qiáng)，豬群暴發(fā)偽狂犬病且高死亡率與毒力增強(qiáng)無關(guān)，但從小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，變異株能讓小鼠產(chǎn)生更為嚴(yán)重的瘙癢癥狀。

gB是PRV必需糖蛋白，也是主要的免疫相關(guān)蛋白，是最保守的蛋白之一，是病毒感染所必需的，與病毒入侵細(xì)胞和在細(xì)胞間傳播密切相關(guān)[20]，產(chǎn)生中和病毒的抗體[21]。gC參與病毒入侵細(xì)胞過程，是PRV最主要的保護(hù)性抗原之一，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生中和抗體[19]，gB和gC的變異性，是偽狂犬病毒的特征；gE不是病毒復(fù)制必需的蛋白，但它是主要的毒力因子之一，呈現(xiàn)出嗜神經(jīng)性，在病毒釋放與傳播中使PRV接觸臨近的神經(jīng)元，從而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)病毒在內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和擴(kuò)散[22]，有研究表明，gE缺失株與其他蛋白缺失株相比親神經(jīng)性更弱，因此gE可能在侵蝕和傳播神經(jīng)系統(tǒng)中有更重要的作用[23]。TK也是主要毒力基因，與建立和激活神經(jīng)潛伏狀態(tài)，在中樞神經(jīng)中增殖有關(guān)[24]，當(dāng)缺失TK時(shí)，病毒增殖不受到影響，但毒力和侵染力大幅度降低[25]，因此在基因缺失苗研發(fā)中常使用缺失TK的PRV毒株。通過gB、gC、gE和TK全基因的遺傳進(jìn)化分析建立進(jìn)化樹，PRV FJ01株、PRV FJ03株和PRV MS2018株與2011年后分離的變異株親緣性相近，而YK株與國外毒株在同一進(jìn)化分支上，與國內(nèi)毒株親緣性較遠(yuǎn)。4株分離PRV的gB核苷酸序列與國內(nèi)外PRV參考株的同源性為97.7%～100%；gC核苷酸序列與國內(nèi)外PRV的同源性為89.3%～99.9%；gE與國內(nèi)外PRV的核苷酸同源性為96.1%～99.8%；TK基因與國內(nèi)外PRV的核苷酸同源性為97.9%～100%。分析各個(gè)毒株分別與2011年至今流行的PRV的毒力基因同源性，發(fā)現(xiàn)同源性較高，說明2011后的流行毒株間變異較小。

通過分離出來的4個(gè)毒株與國內(nèi)市面上主要流通的疫苗毒株如Bartha-K61株和SA215株進(jìn)行基因序列比對有一些變異，雖然目前流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示我國豬場加強(qiáng)疫苗免疫可以大部分防控PRV，但不能完全清除，這與我國還有許多散戶，養(yǎng)殖環(huán)境等有關(guān)，這可能也是PRV仍在流行變異的原因之一[26]。為了防控新變異PRV，以近年流行的PRV為親本研發(fā)新型疫苗可能對豬起免疫保護(hù)作用更加有效；且隨著全基因組測序的普及，關(guān)于PRV遺傳變異的研究越來越多，數(shù)據(jù)庫越來越大，發(fā)現(xiàn)PRV雖然GC含量高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但仍出現(xiàn)變異，YK毒株分離于近年感染偽狂犬病的病料，其免疫原性基因gB、gC和gE與國外毒株相近，TK在進(jìn)化樹上位于獨(dú)立分支上，TK毒株是否出現(xiàn)基因重組，需要從全基因組角度來進(jìn)行進(jìn)一步探究。