莊陽輝，康爭春，王海棠，陳貴珠，陳琪琛，蔡 慧

1.泉州市中醫(yī)院普通外科，泉州 362000 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院普通外科，上海 200433

胃癌是我國乃至全球常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。我國是世界上胃癌的高發(fā)地區(qū)之一，每年至少有50多萬人死于胃癌。因此，早期診斷、早期治療對于降低胃癌的病死率非常重要。隨著我國公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，早期胃癌發(fā)現(xiàn)率越來越高。早期胃癌是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療方式、治療策略、預(yù)后均不同。對于早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的研究顯得十分重要[2]。本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的胃癌RNA-seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選了早期胃癌伴與不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)基因，并分析了其與患者預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的早期診治提供了新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 早期胃癌組織樣本RNA-seq數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理 首先，從癌癥基因組圖譜官方網(wǎng)站(TCGA[3]，https://cancergenome.nih.gov/)下載胃腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)，下載時(shí)間為2019年6月2日。利用Perl 5.26.2軟件，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為gene id表達(dá)矩陣，并將Gene ID改寫成Gene Symbol，對表達(dá)譜信息進(jìn)行編碼蛋白的mRNA抽提。然后下載TCGA數(shù)據(jù)庫胃腺癌患者的臨床生存及病理信息，獲取T1N0M0期和T1N1～3M0期胃癌患者的信息。

1.2 篩選T1N1～3M0期與T1N0M0期胃癌的差異表達(dá)基因 在R 3.5.3環(huán)境下，加載edgeR[4]包。以未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌表達(dá)譜為對照組，以發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌表達(dá)譜為實(shí)驗(yàn)組，篩選兩組的差異表達(dá)基因。以log2FoldChange(差異表達(dá)倍數(shù)取2的對數(shù))絕對值大于1、假發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于0.05為篩選條件，對差異表達(dá)基因聚類熱圖結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.3 差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路富集分析 首先將Gene Symbol轉(zhuǎn)換成Gene ID，在R 3.5.3環(huán)境下，加載clusterProfiler包、org.Hs.eg.db包、enrichplot包、ggplot2包，對上調(diào)、下調(diào)差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析和可視化，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

1.4 差異表達(dá)基因與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 在Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站(http://kmplot.com/analysis/)對差異表達(dá)基因與胃癌患者的生存情況進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷差異表達(dá)基因是否影響患者預(yù)后(由于早期胃癌人群較少，故對全部分期胃癌患者進(jìn)行生存分析，共371例)。分別對上調(diào)差異表達(dá)基因前10個(gè)和下調(diào)差異表達(dá)基因的前5個(gè)進(jìn)行胃癌患者生存相關(guān)性分析。高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)的最佳截?cái)嘀涤删W(wǎng)站的智能化功能自動(dòng)選擇。

2 結(jié) 果

2.1 早期胃癌組織樣本情況 腫瘤組織樣本共646例，其中T1N0M0期14例，T1N1～3M0期5例。檢測基因19 767個(gè)，為HTSeq-Counts數(shù)據(jù)。

2.2 T1N1～3M0期對比T1N0M0期胃癌相比的差異表達(dá)基因 共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因202個(gè)，其中上調(diào)197個(gè)、下調(diào)差異5個(gè)。聚類分析(圖1)顯示，T1N1～3M0期胃癌有獨(dú)特的上調(diào)基因表達(dá)譜。前10個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因的基本信息見表1，5個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因的基本信息見表2。

圖1 差異表達(dá)基因聚類熱圖

紅黑綠不同顏色及顏色深淺代表不同的mRNA表達(dá)量. 熱圖最上方的藍(lán)條代表T1N0M0期胃癌，紅條代表T1N1-3M0期胃癌

表1 T1N1-3M0期對比T1N0M0期胃癌的前10個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因情況

Log2FoldChange：差異表達(dá)倍數(shù)取2的對數(shù)；log2CPM：每百萬片段篩選獲得的該基因片段數(shù)取2的對數(shù)；FDR：假發(fā)現(xiàn)率

表2 T1N1-3M0期對比T1N0M0期胃癌下調(diào)的5個(gè)差異表達(dá)基因情況

Log2FoldChange：差異表達(dá)倍數(shù)取2的對數(shù)；log2CPM：每百萬片段篩選獲得的該基因片段數(shù)取2的對數(shù)；FDR：假發(fā)現(xiàn)率

2.3 差異表達(dá)基因顯著富集的GO功能和KEGG通路情況 由于下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量僅5個(gè)，故不對其進(jìn)行富集分析，僅對上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果(圖2)顯示：上調(diào)差異表達(dá)基因與腫瘤對白細(xì)胞介素-6(IL-6)的反應(yīng)、細(xì)胞對IL-6的反應(yīng)、IL-1生成正向調(diào)節(jié)、IL-1β分泌、細(xì)胞對IL-1的反應(yīng)、腫瘤對腫瘤壞死因子(TNF)的反應(yīng)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)通路、DNA去甲基化等GO功能顯著相關(guān)；上調(diào)差異表達(dá)基因與Wnt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、干細(xì)胞多能性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-受體相互作用、軸突指導(dǎo)、NF-κB信號(hào)通路、胃癌信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-Akt)信號(hào)通路等信號(hào)通路顯著相關(guān)。

圖2 T1N1-3M0期胃癌較T1N0M0期胃癌顯著上調(diào)差異表達(dá)基因富集的GO功能(A)區(qū)域和KEGG通路(B)

2.4 差異表達(dá)基因與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 在前10 個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因中，有6個(gè)與患者總生存期縮短相關(guān)，分別為DPEP3、THPO、HSPA6、SCGB3A2、CLDN6、CACNA1B(圖3)，提示這6個(gè)基因可能與胃癌的惡性表型相關(guān)。5個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因中，有4個(gè)與患者總生存期縮短相關(guān)，分別為HDGFL1、CTRB1、CCL26、OLFM4(圖4)。

圖3 T1N1-3M0期胃癌較T1N0M0期胃癌上調(diào)差異表達(dá)基因與患者生存期的相關(guān)性分析

3 討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的分子調(diào)控機(jī)制和關(guān)鍵分子事件一直是我國腫瘤科研工作的重點(diǎn)。早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌早期侵襲的標(biāo)志性事件之一，是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與早期胃癌的預(yù)后密切相關(guān)[5]。本研究以早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)為切入點(diǎn)，利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜數(shù)據(jù)，探索可能影響胃癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)基因及其富集的功能區(qū)域、信號(hào)通路，并探索其是否影響胃癌的惡性表型，進(jìn)而影響胃癌預(yù)后。

目前，國內(nèi)外關(guān)于早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的研究較多。閔叢叢等[6]發(fā)現(xiàn)，浸潤深度、分化程度、是否合并潰瘍是影響早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵病理因素；王力等[7]通過回顧性分析242例早期胃癌病例，證明腫瘤浸潤深度、脈管瘤栓是早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著相關(guān)因素；周羽翙等[8]則通過回顧性分析更大樣本量(417例)早期胃癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、浸潤深度、組織學(xué)類型、性別4個(gè)因素獨(dú)立影響早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有學(xué)者[9]繪制了曲線下面積(AUC)達(dá)0.860的列線圖，用于評(píng)估各個(gè)臨床病理因素對早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的權(quán)重。然而，目前關(guān)于在基因表達(dá)層面評(píng)估早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素的報(bào)道較少。

圖4 T1N1-3M0期胃癌較T1N0M0期胃癌下調(diào)差異表達(dá)基因與生存期的相關(guān)性分析

本研究通過生物信息學(xué)方法，篩選出早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相對于早期胃癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組顯著上調(diào)和下調(diào)的基因，首先發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)差異表達(dá)的基因占了差異表達(dá)基因的絕大部分，下調(diào)差異表達(dá)基因僅有5個(gè)。對兩類組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)其聚類明顯，早期胃癌具有獨(dú)特的表達(dá)譜特征。該現(xiàn)象說明發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌可能通過多個(gè)癌基因和癌癥相關(guān)信號(hào)通路的激活而促進(jìn)早期侵襲事件的發(fā)生，而抑癌基因的失活對胃癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用并不明顯。上調(diào)差異表達(dá)的197的基因富集在以IL-1[10]、IL-6[11]、TNF[12]介導(dǎo)的促增殖相關(guān)GO功能區(qū)域，且干細(xì)胞多能性的調(diào)節(jié)、ECM-受體相互作用、軸突指導(dǎo)、NF-κB信號(hào)通路[13]及胃癌信號(hào)通路也多證實(shí)與癌癥密切相關(guān)，提示胃癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究可以從這些方面入手。

本研究還發(fā)現(xiàn)，早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌差異表達(dá)基因多與胃癌預(yù)后相關(guān)，提示其可能影響胃癌的惡性表型。其中，上調(diào)差異表達(dá)顯著性前10的基因中，有6個(gè)高表達(dá)與早期胃癌不良預(yù)后相關(guān)；下調(diào)差異表達(dá)全部5個(gè)基因中，有4個(gè)低表達(dá)與早期胃癌不良預(yù)后顯著相關(guān)。該結(jié)論與GO功能和KEGG通路富集互相論證，為預(yù)后標(biāo)志物及相關(guān)分子機(jī)制研究提供了參考。

早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌中高表達(dá)前10個(gè)基因和低表達(dá)基因中，已有部分被報(bào)道。目前已發(fā)現(xiàn)MUC12[14]、CLDN6[15]在胃癌預(yù)后評(píng)估方面具有重要價(jià)值；Cui等[16]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)，MUC12在其研究的5組配對胃癌組織中最常見；Oh等[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-486通過靶向嗅素蛋白4(OLFM4)調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖活性； PIWIL2蛋白家族[18]則可以作為人類胃癌的預(yù)測標(biāo)志物。部分基因雖未在胃癌中被報(bào)道，但在其他惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)有重要的生物學(xué)意義，如：DPEP3高表達(dá)與三陰乳腺癌不良預(yù)后密切相關(guān)[19]；THPO等5個(gè)基因表達(dá)譜模式在肺腺癌和肺鱗癌中存在顯著差異[20]；CPA1的突變可增加胰腺癌的遺傳易感性，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展[21]；HSPA6的表達(dá)上調(diào)與HBV相關(guān)的早期肝細(xì)胞肝癌不良預(yù)后相關(guān)[22]。這些基因給我們在胃癌的研究中提供了一個(gè)很好的思路和方向。也有腫瘤相關(guān)基因在惡性腫瘤中的研究缺乏，如TRIM43、HDGFL1、CTRB1等，均是潛在的重要研究對象。

綜上所述，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)掘早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因，并從GO功能、KEGG通路富集層面及其與預(yù)后相關(guān)性方面分析了差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義，為更深入的胃癌調(diào)控機(jī)制研究提供了參考。這些差異表達(dá)基因并有可能作為胃癌的診治靶標(biāo)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。