姜瑞鳳 衣少娜 王媛媛 葛 俊

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，煙臺264100)

腎臟作為機體的主要排泄器官，是排出異源性物質(zhì)的主要代謝場所，因此最容易受到毒性損傷。化學(xué)和藥物誘導(dǎo)的腎毒性是急性腎損傷的主要原因，也是引起腎損傷發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]。CCl4是一種可以誘導(dǎo)動物血液生化和氧化應(yīng)激參數(shù)改變的環(huán)境污染物。CCl4引起的腎臟損傷機制與引起的肝臟損傷機制相一致，主要通過細胞色素P450 CYP2E1代謝產(chǎn)生高毒性三氯甲基(-CCl3)和過氧三氯甲基(-OOCCl3)引起腎損傷。有研究表明CCl4誘導(dǎo)腎臟中的脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和細胞膜損傷，因此常用CCl4作為評估抗腎損傷藥物的藥效和探索藥物性腎損傷發(fā)病機制等試驗研究的急性腎損傷的誘導(dǎo)劑[2]。松果菊苷(Echinacoside，ECH) 是一種天然苯乙醇苷類化合物，存在于大量中藥中，如管花肉蓯蓉、地黃、玄參、馬先蒿、列當(dāng)?shù)?，尤其在管花肉蓯蓉中含量最高，可達30%[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷主要具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護肝臟、保護神經(jīng)和改善記憶力的作用[3-6]，但松果菊苷對腎損傷的作用并不清楚。本文主要研究松果菊苷對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷的保護作用及機制，探究其潛在的治療性價值。

1 材料與方法

1.1材料 健康清潔級雌Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，4 周齡，體質(zhì)量為70～90 g，購自武漢大學(xué)實驗動物中心；食用橄欖油購自西班牙RONGS；CCl4購自天津市富宇精細化工有限公司；尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(Serum creatinine，Scr)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒購自南京建成；TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司；ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CCl4誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型的建立 將大鼠隨機分為5組，每組10只。Ctrl組：一次性腹腔注射300 μl生理鹽水；CCl4組：采用0.5%CCl4橄欖油溶液灌胃造模，灌胃量為10 mg/kg；給藥組：CCl4+ ECH(7.5 mg)組：CCl4組大鼠腹腔注射松果菊苷注射量為7.5 mg/kg；CCl4+ ECH(15 mg)組：CCl4組大鼠腹腔注射ECH注射量為15 mg/kg；CCl4+ECH(30 mg)組：CCl4組大鼠腹腔注射ECH注射量為30 mg/kg。在給藥48 h 后，提尾然后收集大鼠的尿液。接著腹腔注射麻醉后處死大鼠，心臟采集全血，然后離心并收集血清。最后，開腹收集腎組織標(biāo)本進行包埋固定和液氮冷凍保存。

1.2.2腎功能指標(biāo)的檢測 用 7600 全自動生化分析儀測定蛋白尿(Proteinuria)、血清肌酸酐(Serum creatinine，Ser)和尿素氮(Urea nitrogen，BUN)的水平。

1.2.3HE染色 將大鼠的腎組織置于10%中性甲醛溶液固定，然后脫水、透明和包埋，從而制成石蠟包埋塊。將腎組織切片常規(guī)脫蠟至水后，水洗，蘇木精液染色，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，水洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗，0.5%伊紅液染色，蒸餾水洗，脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片，在400倍顯微鏡觀察。

1.2.4腎組織TUNEL染色 將切好的腎組織切片按照TUNEL染色試劑盒說明書操作，在400倍顯微鏡觀察并記錄每個視野中總細胞數(shù)及陽性細胞數(shù)。

1.2.5免疫組化 大鼠的腎組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)、山羊血清封閉后，與單克隆一抗(1∶500) 4℃孵育過夜。與Caspase-3生物素標(biāo)記二抗(1∶100)孵育，最后經(jīng)DAB顯色、質(zhì)染。在400倍顯微鏡下觀察，并用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件分析免疫組化圖。

1.2.6Western blot 用RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，并用BCA法檢測蛋白含量。然后通過SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。接著在室溫條件下，用脫脂牛奶封閉蛋白。接著加入一抗 (BAX，1∶1 000;Bcl-2，1∶1 000;TLR4，1∶1 000;NF-κB P65，1∶1 000)，在4℃封閉過夜。第2天在室溫條件下，加入相對應(yīng)二抗封閉。最后加入ECL進行曝光。

1.2.7ELISA檢測 按照ELISA試劑盒說明操作。將純化的抗體包被微孔板制作成固相載體。然后依次加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體和 HRP 標(biāo)記的親和素。洗滌后用底物 TMB 顯色。最后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(A值)，并計算樣品中濃度。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腎功能比較 測定各組大鼠的蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮，結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠的蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量顯著增多，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨ECH給藥量的增加，蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖1)。

2.2腎組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示：CCl4組可見腎小管上皮細胞變性，腎小管囊腔明顯緊縮，腎小球開始萎縮退化，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤，細胞存在大量腫脹、壞死和脫落；給藥ECH組腎臟仍然存在腎小球和腎小管細胞腫脹、壞死和脫落等情況，但損傷程度均較CCl4組輕，特別是CCl4+ECT(30 mg)組與Ctrl組正常腎組織基本一致，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用(圖2)。

TUNEL染色結(jié)果顯示：CCl4組與Ctrl組相比，細胞凋亡數(shù)目顯著增多，腎組織存在明顯損傷；給藥ECH組與CCl4組相比較，細胞凋亡數(shù)目顯著減少，ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨ECH給藥量的增加，細胞凋亡數(shù)目逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖2)。

2.3腎組織Caspase-3、BAX和Bcl-2檢測 免疫組化檢測Caspase-3，結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠腎組織的Caspase-3陽性細胞百分比顯著增多，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的Caspase-3陽性細胞百分比顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨ECH給藥量的增加，腎組織的Caspase-3陽性細胞百分比逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖3A)。

圖1 各組大鼠腎功能指標(biāo)的統(tǒng)計Fig.1 Statistics of renal function indicators in each group of ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group；##.P<0.01 versus CCl4 group.

圖2 腎組織HE染色和TUNEL染色結(jié)果圖(×400倍)Fig.2 Results of HE staining and TUNEL staining of kidney tissue (×400 times)Note: **.P<0.01 versus Ctrl group；##.P<0.01 versus CCl4 group.

WB檢測結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠腎組織的BAX表達量顯著減少，Bcl-2表達量顯著增多，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的BAX表達量顯著增多，Bcl-2表達量顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨ECH給藥量的增加，腎組織的BAX表達量逐漸增多，Bcl-2表達量逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖3B)。

2.4炎性因子檢測 ELISA檢測血清中炎癥因子，結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著增加，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷炎癥因子表達具有抑制作用；并隨ECH給藥量的增加，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷炎癥因子表達具有抑制作用隨著ECH量的增加而加強(圖4)。

2.5TLR4、 P65和 VCAM-1的表達的檢測 Western blot檢測結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠腎組織的TLR4、 P65和VCAM-1表達量顯著增多，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的TLR4、P65和VCAM-1表達量顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨ECH給藥量的增加，腎組織的TLR4、P65和VCAM-1逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖5A)。

圖3 各組大鼠腎組織中Caspase-3、BAX和Bcl-2檢測Fig.3 Detection of Caspase-3，BAX and Bcl-2 in renal tissues of ratsNote: Caspase-3 was detected by immunohistochemistry (400 times);BAX and Bcl-2 expression were detected by WB;**.P<0.01 versus Ctrl group；##.P<0.01 versus CCl4 group.

圖4 ELISA檢測血清炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α含量Fig.4 Detection of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α by ELISANote: **.P<0.01 versus Ctrl group；##.P<0.01 versus CCl4 group.

圖5 Western blot檢測TLR4，P65和 VCAM-1的表達量Fig.5 Expression of TLR4，P65 and VCAM-1 was detect-ed by Western blotNote: **.P<0.01 versus Ctrl group；##.P<0.01 versus CCl4 group.

免疫組化檢測VCAM-1，結(jié)果顯示：與Ctrl組相比，CCl4組大鼠腎組織的VCAM-1陽性細胞所占比例顯著增多，說明CCl4誘導(dǎo)腎損傷模型構(gòu)建成功；與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的VCAM-1陽性細胞所占比例顯著減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用；并隨著ECH給藥量的增加，腎組織的VCAM-1陽性細胞所占比例逐漸減少，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用且隨著給藥量而增加(圖5B)。

3 討論

急性腎損傷是臨床常見的短期內(nèi)發(fā)生腎功能異常所導(dǎo)致的危急重癥，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。當(dāng)腎臟功能正常時，在尿液中蛋白含量很微弱，而當(dāng)腎臟受到損傷時，尿液中會出現(xiàn)大量蛋白。所以，本研究用蛋白尿來檢測腎臟的受損。而血清肌酸酐和尿素氮是常用的檢測腎臟疾病的典型指標(biāo)。Sajid等[7]研究發(fā)現(xiàn)CCl4誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中血清肌酸酐和尿素氮明顯升高，這與我們的實驗CCl4誘導(dǎo)大鼠腎損傷模型結(jié)果相一致，證明我們的CCl4誘導(dǎo)大鼠腎損傷模型構(gòu)建成功有效。Hamed 等[8]研究駱駝乳對CCl4誘導(dǎo)老鼠腎損傷保護作用時發(fā)現(xiàn)駱駝乳可以降低CCl4模型組的血清肌酸酐和尿素氮的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷也可以降低CCl4模型組的血清肌酸酐和尿素氮的含量，所以松果菊苷對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷起保護作用。

除了利用蛋白尿、清肌酸酐和尿素氮含量的測定外，HE染色可以清楚地觀察到腎損傷的情況。Hiroki等[9]研究用硫酸鋅預(yù)防CCl4引起的小鼠腎毒性時通過HE染色，發(fā)現(xiàn)CCl4模型組腎小管近端出現(xiàn)細胞的腫脹、變性和蛋白質(zhì)滲透，而硫酸鋅處理組的腎小管、腎小球和腎小管間質(zhì)細胞的形態(tài)與對照組相似。本研究通過HE染色，發(fā)現(xiàn)CCl4組大鼠腎小管上皮細胞已經(jīng)變性，腎小管囊腔明顯緊縮，空泡樣明顯變化，腎小球萎縮退化，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤，細胞存在大量腫脹、壞死和脫落，而CCl4+ECT(30 mg)組與Ctrl組正常腎組織基本一致，說明ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷具有保護作用。

急性腎損傷中存在著大量的細胞凋亡。Zhang等[10]表明細胞凋亡是急性腎損傷后腎小管細胞死亡的重要特征。本研究通過TUNEL染色檢測細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)CCl4組較Ctrl組細胞凋亡數(shù)目明顯增多，給藥ECT組較CCl4組的細胞凋亡數(shù)目顯著減少，這說明ECH可以抑制腎細胞的凋亡。而Caspase-3是多種刺激誘導(dǎo)細胞凋亡的主要介質(zhì)，活化的Caspase-3可以分解核纖層蛋白，導(dǎo)致DNA片段化，從而導(dǎo)致細胞凋亡。Shi等[11]研究組蛋白脫乙?；?對腎損傷的抑制作用時發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰基酶6能降低腎損傷細胞的Caspase-3表達，減少細胞的凋亡。這與我們的免疫組化檢測Caspase-3的結(jié)果相一致，與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的Caspase-3陽性細胞百分比顯著減少，說明ECH可以抑制腎細胞的凋亡。凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族是細胞凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，主要有抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白BAX[12]。Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜的胞漿面，通過抑制線粒體膜電位的降低、抑制凋亡誘導(dǎo)因子AIF和細胞色素C的釋放來抑制細胞凋亡。BAX恰好相反，主要分布在細胞質(zhì)中，凋亡誘導(dǎo)信號促使BAX構(gòu)象改變，并整合于線粒體的外膜，促使細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子AIF的釋放，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)：與CCl4組相比，給藥ECH組大鼠的腎組織的BAX表達量顯著增多，Bcl-2表達量顯著減少，說明ECH抑制腎細胞的凋亡。

構(gòu)成炎性細胞網(wǎng)絡(luò)的IL-1β、IL-6和TNF-α等多種細胞因子，參與各種組織損傷的病理過程。Reilly等[13]發(fā)現(xiàn)過量釋放炎癥因子如IL-1β、IL-6，TNF-α?xí)l(fā)敗血癥誘導(dǎo)腎損傷。Li等[14]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以減少炎性細胞前炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β和 IL-8 )的產(chǎn)生，從而減輕由同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α參與了LPS誘導(dǎo)的腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)ECH對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表達下調(diào)，這說明ECH對腎組織的發(fā)炎具有抑制作用。

VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，是廣泛使用的臨床上炎性檢測標(biāo)志。VCAM-1 表達升高則腎小球濾過率下降，可以直接反映腎臟的炎性活動情況[16，17]。TLR4在腎損傷的病理生理學(xué)機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR4 和核因子-κB(NF-κB) 在正常腎臟組織中均有表達，并且相關(guān)信號通路可能參與了腎損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[18，19]。不同原因誘導(dǎo)的腎損傷動物模型中，均存在腎臟組織促炎細胞因子、TLR4、磷酸化 NF-κBp65 表達上調(diào)，用藥物阻斷或抑制上述分子的表達就能夠預(yù)防后續(xù)炎癥反應(yīng)，從而促進組織修復(fù)，對腎損傷起到保護[20]。Shi等[21]研究發(fā)現(xiàn)吡喃查耳酮衍生物下調(diào)TLR4和NF-κBp65表達，抑制LPS誘導(dǎo)的腎損傷大鼠的TLR4/NF-κB通路。本研究發(fā)現(xiàn)給藥ECH組大鼠的腎組織的TLR4、P65和VCAM-1表達量顯著減少，說明ECH可以抑制CCl4誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷的TLR4/NF-κB通路。

綜上所述，松果菊苷對CCl4誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷起保護作用，相關(guān)機制可能與松果菊苷抑制細胞凋亡、抑制炎癥產(chǎn)生和抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。這為腎損傷的防治提供參考數(shù)據(jù)，其具體機制仍有待進一步深入研究。