（河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的難點(diǎn)問題，國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者對(duì)PMI的研究多集中于早期PMI的推斷，對(duì)晚期PMI的推斷缺乏既簡(jiǎn)單、精確又行之有效的方法[1-2]。由于尸體腐敗受到自身與環(huán)境因素的影響，使得晚期PMI的推斷變得極其復(fù)雜[3]。近年來，盡管越來越多的方法和技術(shù)已應(yīng)用于PMI推斷研究，但多數(shù)方法處于理論研究階段。采用各種方法推斷出的PMI也只是一個(gè)大致時(shí)間，誤差較大。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的PMI推斷方法是當(dāng)前法醫(yī)病理學(xué)的重要任務(wù)。

前期研究結(jié)果[4]表明，大鼠腦組織電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）隨晚期PMI的延長(zhǎng)而逐漸增大，展現(xiàn)出了利用組織器官EC推斷晚期PMI的良好應(yīng)用前景。然而，EC最初是食品科學(xué)中檢測(cè)肉類腐敗程度的一種電化學(xué)指標(biāo)，其測(cè)定值的大小為樣本中各種導(dǎo)電離子的總和。因此，本研究旨在觀察大鼠腦組織浸漬液EC及其相關(guān)生化指標(biāo)的變化，在研究多指標(biāo)聯(lián)合推斷PMI的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究EC電化學(xué)變化的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康無病原體SD大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量為（280±20）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在同一時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫臼法將大鼠全部處死后，隨機(jī)分成8組，每組5只，將大鼠尸體保存于25℃左右的室內(nèi)環(huán)境中。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

FE30精密電導(dǎo)率儀（瑞士Mettler Toledo公司），ZY-1280全自動(dòng)生化分析儀（上?？迫A生物工程股份有限公司），Discovery電子天平（美國(guó)Ohaus公司），KFR-26GW變頻空調(diào)（珠海格力集團(tuán)有限公司）。

1.3 腦組織EC及化學(xué)成分的測(cè)定

于死后不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、3、4、5、6、7d）提取大鼠的全腦組織并準(zhǔn)確稱量，將腦組織置于研缽中研磨，并與去離子水混合制成質(zhì)量濃度為0.1g/mL的勻漿浸漬液，將浸漬液用0.45 μm濾膜過濾并均分成2份。其中1份浸漬液用電導(dǎo)率儀即刻測(cè)定其EC值并記錄（溫度補(bǔ)償系數(shù)設(shè)定為2%/℃），同時(shí)利用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)另1份浸漬液中的鉀離子、鈉離子、氯離子、鈣離子、無機(jī)磷、鎂離子、尿酸、尿素氮及肌酐共9種化學(xué)物質(zhì)的含量即刻進(jìn)行測(cè)定并分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 腦組織浸漬液中EC與PMI的關(guān)系

大鼠死后7 d內(nèi)腦組織浸漬液EC的測(cè)定值見表1。腦組織EC隨PMI的延長(zhǎng)而逐漸增大，其中：0～1d，EC值增大無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2～7d，EC值隨PMI的延長(zhǎng)快速增大。腦組織EC（x）與PMI（y）的二次回歸方程為：y=48.22x2+14.31x+1181.46（R2=0.96，P＜0.05）。

表1 腦組織EC隨PMI的變化（n=5，±s，μS/cm）

表1 腦組織EC隨PMI的變化（n=5，±s，μS/cm）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05。

1188.20±26.62 1238.00±18.18 1498.80±153.961）1769.00±154.881）2226.00±428.981）2520.40±518.361）2866.00±480.611）3446.00±476.721）PMI 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d EC

2.2 腦組織浸漬液中各生化指標(biāo)與PMI的關(guān)系

大鼠死后7d內(nèi)腦組織浸漬液中各生化指標(biāo)的測(cè)定值見表2。結(jié)果顯示：大鼠腦組織浸漬液中尿酸、尿素氮、無機(jī)磷的含量在大鼠死后1d內(nèi)均無明顯變化，而在2～7 d隨PMI的延長(zhǎng)開始快速上升，其整體變化規(guī)律均與EC大致相同；鉀離子、鈣離子、鎂離子、肌酐4種生化指標(biāo)與PMI的相關(guān)性均較差，在測(cè)定區(qū)間內(nèi)離散度較大，整體變化無明顯規(guī)律性，其中鉀離子在測(cè)定區(qū)間內(nèi)始終保持穩(wěn)定，鈣離子、鎂離子和肌酐雖然有一定的變化，但在測(cè)定區(qū)間內(nèi)這3種物質(zhì)的變化規(guī)律無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PMI的相關(guān)性較差；鈉離子、氯離子僅在2d內(nèi)測(cè)定出結(jié)果，而2d后未檢測(cè)出其濃度值。

對(duì)死后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中尿酸、尿素氮、無機(jī)磷的測(cè)定值（x）進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，其與PMI（y）的二次回歸方程分別為y=1.04 x12+1.68 x1+13.16（R2=0.97，P＜0.05），y=0.24 x22-0.04 x2+0.59（R2=0.99，P＜0.05），y=0.05 x32-0.01 x3+2.39（R2=0.95，P＜0.05），其中x1為尿酸、x2為尿素氮、x3為無機(jī)磷。

表2 腦組織浸漬液各生化指標(biāo)隨PMI的變化 （n=5，±s）

表2 腦組織浸漬液各生化指標(biāo)隨PMI的變化 （n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05；“-”表示未檢出。

PMI 0d14.20±3.540.59±0.102.40±0.058.05±0.200.13±0.020.97±0.171.00±0.63 d13.80±3.871）0.77±0.092.38±0.137.06±0.210.11±0.021）1.00±0.123.80±1.17 d21.00±4.741）1.76±0.851）2.51±0.177.07±0.430.13±0.021）0.87±0.221）14.60±6.97 d29.80±9.241）2.57±0.671）2.87±0.441）7.58±0.360.17±0.031）1.09±0.091）80.40±56.881）d35.60±16.301）4.59±2.371）3.53±0.441）7.38±0.610.13±0.021.19±0.101）58.00±47.111）d53.20±10.651）6.61±3.461）3.60±0.721）7.23±0.651）0.25±0.211.15±0.1027.36±18.171）d59.20±9.501）8.33±2.451）4.22±0.541）7.75±1.051）0.19±0.031.13±0.0856.70±32.61 d66.00±24.451）11.95±3.921）4.45±0.431）7.98±0.381）0.15±0.061.23±0.0621.47±10.19 1234567尿酸/（μmol·L-1）肌酐/（μmol·L-1）鈉離子/（mmol·L-1）0.25±0.02 0.17±0.02 3.38±0.31氯離子/（mmol·L-1）1.47±0.11 0.07±0.64 2.59±0.14尿素氮/（mmol·L-1）無機(jī)磷/（mmol·L-1）鉀離子/（mmol·L-1）鈣離子/（mmol·L-1）鎂離子/（mmol·L-1）----------

2.3 腦組織浸漬液中EC與尿酸、尿素氮及無機(jī)磷的關(guān)系

分析EC與尿酸、尿素氮及無機(jī)磷的線性關(guān)系，結(jié)果顯示：EC與尿酸、尿素氮及無機(jī)磷的一次回歸方程擬合度均較高。3種生化指標(biāo)（x）與EC（y）的線性方程分別為 y=0.02 x1-15.54（R2=0.97），y=0.005 x2-5.71（R2=0.99），y=4.98x3+1.15（R2=0.97），其中x1為尿酸、x2為尿素氮、x3為無機(jī)磷。

3 討 論

EC的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，其最初為食品科學(xué)中評(píng)價(jià)肉類產(chǎn)品新鮮程度及貨架期的研究指標(biāo)，已廣泛用于食品衛(wèi)生部門對(duì)肉類的檢測(cè)[5-7]。食品科學(xué)的研究對(duì)象為肉制品，法醫(yī)學(xué)的研究對(duì)象為尸體，兩者均為肉類腐敗變質(zhì)的過程。因此，將EC的測(cè)定用于法醫(yī)學(xué)中PMI的推斷是一種重要的研究思路[8]。本課題組前期已研究了大鼠不同組織EC與PMI的關(guān)系[4]，結(jié)果顯示，大鼠不同組織EC隨PMI變化顯著，其EC隨PMI延長(zhǎng)均呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。由于腦組織結(jié)構(gòu)相對(duì)封閉，受外界因素影響相對(duì)較少，且距離腸道組織較遠(yuǎn)，是推斷PMI的理想組織，因此本研究選取腦組織為研究對(duì)象，測(cè)定腦組織浸漬液EC及相關(guān)生化指標(biāo)的變化，研究EC及多種生化指標(biāo)的變化與晚期PMI的關(guān)系，并進(jìn)一步探究EC電化學(xué)變化的內(nèi)在機(jī)制。

本研究測(cè)定了大鼠死后不同時(shí)間間隔腦組織浸漬液EC及相關(guān)化學(xué)成分的含量，研究并分析了EC及相關(guān)生化指標(biāo)隨PMI的變化關(guān)系。結(jié)果顯示：腦組織浸漬液EC、尿酸、尿素氮、無機(jī)磷隨PMI的延長(zhǎng)而逐漸增大，R2為0.95～0.99，浸漬液中鉀離子、鈉離子、氯離子、鎂離子、鈣離子、肌酐隨PMI的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中，大鼠腦組織EC隨PMI的變化規(guī)律與前期研究[9]結(jié)果一致：0～1d，其EC值均無明顯變化，處于平臺(tái)期；2～7 d，均隨PMI的延長(zhǎng)而快速增大，體現(xiàn)了EC變化的穩(wěn)定性。腦組織浸漬液中尿酸、尿素氮的含量隨PMI延長(zhǎng)而逐漸增加，其可能原因?yàn)椋捍笫笏篮箅S著腐敗的進(jìn)行，其組織內(nèi)蛋白質(zhì)逐漸降解為一系列含氮類的堿性物質(zhì)[9]，如尿酸、尿素氮等。因此，此兩種物質(zhì)的含量變化與EC類似，在0～1d無變化而在2～7d快速增加。同時(shí)，腦組織中磷脂的含量豐富，其相應(yīng)的磷脂結(jié)合蛋白含量較其他組織多，因此，隨著腐敗的進(jìn)行其無機(jī)磷含量逐漸增加。本研究還分析了大鼠腦組織浸漬液EC與尿酸、尿素氮、無機(jī)磷3種生化指標(biāo)變化的線性關(guān)系，結(jié)果顯示，此3種生化指標(biāo)的變化與EC的一次回歸方程擬合度較好，R2為0.97～0.99。此結(jié)果側(cè)面反映出與大鼠腐敗相關(guān)的生化指標(biāo)和EC變化的一致性，從而初步探究了大鼠腦組織浸漬液EC電化學(xué)變化的內(nèi)在機(jī)制。腦組織浸漬液中鉀離子、鈣離子、鎂離子、肌酐4種指標(biāo)隨PMI的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其可能原因?yàn)椋捍?種物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)含量較為穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)采用物理方法（研磨）將組織細(xì)胞徹底打破。因此，大鼠尸體的腐敗程度對(duì)此4種指標(biāo)的含量變化影響較小。鈉離子、氯離子僅在2d內(nèi)可測(cè)定出結(jié)果，而2d后以現(xiàn)有的生化分析儀檢測(cè)不出其含量，具體變化機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究探討了大鼠腦組織EC及其相關(guān)生化指標(biāo)隨PMI的變化關(guān)系，初步探究了EC推斷PMI的內(nèi)在變化機(jī)制，尸體腐敗過程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的其他含氮類物質(zhì)（除尿酸、尿素氮外）的變化規(guī)律是本課題組下一步的研究方向。同時(shí)，由于尸體的腐敗受到個(gè)體與環(huán)境因素的雙重影響，因此，多指標(biāo)、多因素、多數(shù)據(jù)的聯(lián)合應(yīng)用將是PMI研究的重點(diǎn)方向。