呂葉輝 ，黎世瑩 ，李志宏 ，陶瑞旸 ，3，邵煜 ，胡茜 ，楊智昉 ，陳憶九 ，3

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610065）

隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展及學(xué)科融合，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）這一生物大分子在死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷、死亡原因分析、不同體液鑒定等方面的相關(guān)研究日益深入，已成為法醫(yī)學(xué)研究焦點(diǎn)之一[1-3]。與信使RNA（messenger RNA，mRNA）相比，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）不編碼蛋白質(zhì)，如微小RNA（microRNA，miRNA），其長(zhǎng)度只有18～24 nt，在生物體內(nèi)廣泛存在，表達(dá)具有組織特異性和高度穩(wěn)定性，是法醫(yī)學(xué)研究理想的分子標(biāo)志物[4-5]。

與凍存組織相比，甲醛固定石蠟包埋（formaldehyde-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織能保存多年，是法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐和回顧性研究中最常使用的樣本。隨著RNA提取技術(shù)的進(jìn)步，已有研究[6-8]證實(shí)在FFPE樣本中可提取到一定質(zhì)量的RNA，并用于下游定量分析。但是，現(xiàn)有研究的FFPE樣本主要集中在醫(yī)院手術(shù)取材病理組織，缺乏法醫(yī)學(xué)尸檢來(lái)源FFPE樣本中RNA提取及定量研究的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以不同PMI的人體組織為研究材料，定量檢測(cè)管家基因mRNA、miRNA等多種RNA在同一組織凍存樣本及FFPE樣本中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

9700型PCR儀、7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AB公司），NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），2100生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）。

RNAlater保護(hù)液（日本TaKaRa公司），TRIzolTMPlus RNA Purification試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），RNeasy FFPE試劑盒、miScriptⅡ RT試劑盒、Quanti-Nova SYBR Green PCR試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水。

1.2 樣本收集及總RNA提取

選取4例上海市公安局物證鑒定中心的檢案案例，每例均有詳細(xì)的卷宗記錄，編號(hào)為1、2、3和4，PMI分別為6h、17h、45h及70h。死者尸體解剖前未經(jīng)凍融過(guò)程，解剖時(shí)取腦組織（左額葉皮質(zhì)）、心肌組織（心尖）及肝組織（左葉），一部分保存在RNAlater保護(hù)液中后置于-80℃凍存?zhèn)溆?，另一部分進(jìn)行常規(guī)10%甲醛固定（固定時(shí)間為20h）、石蠟包埋處理后常規(guī)保存?zhèn)溆?。本研究方案及樣本取材通過(guò)倫理委員會(huì)審查，并均獲得家屬知情同意。對(duì)于凍存樣本，精確稱取50g組織按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并去除基因組DNA（genomic DNA，gDNA）；對(duì)于FFPE樣本，保存1年后進(jìn)行6 μm連續(xù)厚切片，每5片放入DEPC水滅菌的微量離心管后，使用RNeasy FFPE試劑盒提取總RNA并去除gDNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量濃度及純度，分別用ng/μL及260nm和280nm波長(zhǎng)下的光密度比值（D260/D280）表示。使用2100生物分析儀測(cè)定RNA完整性，用RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）表示，10為RNA完整性最好，0為最差。

1.3 指標(biāo)選擇

本研究選擇4種ncRNA作為指標(biāo)，分別為腦組織特異性微小RNA-125b（microRNA-125b，miR-125b）、心肌組織特異性微小RNA-1（miR-1）、肝組織特異性微小RNA-122（miR-122）及5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）。上述指標(biāo)的下游引物為通用特異性引物（miScript primer），上游引物（5′→3′）分別為：miR-125b，TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；miR-1，TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT；miR-122，TGGAG TGTGACAATGGTGTTTG；5S rRNA，TCTCGTCTGAT CTCGGAAGC。此外，選擇管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，ACTB），并根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]或設(shè)計(jì)不同產(chǎn)物長(zhǎng)度的引物（較長(zhǎng)的用“-L”標(biāo)識(shí)，較短的用“-S”標(biāo)識(shí)），具體如下：GAPDH前引物為共用的CCACATCGCTCAGACACCAT，GAPDHL（323 bp）后 引 物 為 AAGACGCCAGTGGACTCCA，GAPDH-S（71bp）后引物為ACCAGGCGCCCAATACG；ACTB前引物為共用的GCATGGGTCAGAAGGATTCC，ACTB-L（276 bp）后引物為 TGGATAGCAACGTACA TGGC，ACTB-S（58 bp）后引物為 AGGATGCCTCTCT TGCTCTG。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照說(shuō)明書(shū)，使用miScriptⅡ RT試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT），合成的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）置于-20℃?zhèn)溆茫皇褂肣uantiNova SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制20μL反應(yīng)體系，并應(yīng)用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本重復(fù)3次，結(jié)果由系統(tǒng)自動(dòng)生成，從而得到各RNA指標(biāo)的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別將4例凍存或FFPE混合樣本的cDNA進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋后作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的cDNA模板，進(jìn)行上述qPCR反應(yīng)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的主要參數(shù)包括斜率（k）、截距（b）及決定系數(shù)（R2），并通過(guò)公式E=（10-1/k-1）×100%計(jì)算樣本的擴(kuò)增效率（E）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用RefFinder工具[11]對(duì)各指標(biāo)的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，篩選內(nèi)參指標(biāo)，并對(duì)其他RNA指標(biāo)進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理（ΔCt=Ct指標(biāo)-Ct內(nèi)參）后，運(yùn)用2-ΔΔCt法分析各指標(biāo)的表達(dá)情況，使用SPSS 22.0軟件對(duì)D260/D280、RIN及擴(kuò)增效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 RNA質(zhì)量濃度、純度和完整性

兩種樣本提取所得的總RNA均經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)量濃度和純度，結(jié)果如下。在凍存樣本中，腦組織所提取的RNA質(zhì)量濃度為608ng/μL，心肌組織為 449 ng/μL，肝組織為 839 ng/μL，均高于FFPE樣本所提取的RNA質(zhì)量濃度［208 ng/μL（腦組織）、132ng/μL（心肌組織）及342ng/μL（肝組織），P＜0.05］。大部分樣本RNA的D260/D280值在1.7～2.0，兩種樣本間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明所提取的RNA純度均較高。

每例樣本均檢測(cè)其RIN，結(jié)果如圖1所示。各組織凍存樣本的RIN值與PMI（6h、17h、45h及70h）有關(guān)，隨著PMI延長(zhǎng)逐漸降低。各組織凍存樣本的RIN值均明顯高于同一組織FFPE樣本的RIN值，表明經(jīng)甲醛固定石蠟包埋處理后，RNA的完整性顯著下降。

圖1 案例1～4中各組織樣本的RIN

2.2 RT-qPCR及擴(kuò)增效率

在所有組織凍存樣本中，對(duì)各RNA指標(biāo)均進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增并獲得Ct值，觀測(cè)其擴(kuò)增曲線及溶解曲線，擴(kuò)增曲線為標(biāo)準(zhǔn)“S”形曲線，溶解曲線呈單峰，且多樣本重合度高，表明各樣本RNA指標(biāo)均成功特異性擴(kuò)增。在FFPE樣本中，總RNA亦均成功反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行RT-qPCR定量，除GAPDH-L和ACTB-L在部分FFPE樣本（3號(hào)案例的肝組織及4號(hào)案例的3種組織）中Ct值超過(guò)檢測(cè)閾值，其余RNA指標(biāo)均成功特異性擴(kuò)增。

擴(kuò)增效率計(jì)算使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以凍存腦組織miR-125b為例，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，k=-3.349，即miR-125b的擴(kuò)增效率為98.9%。各RNA指標(biāo)在不同樣本中的平均擴(kuò)增效率如圖3所示。在凍存樣本中，各指標(biāo)的擴(kuò)增效率都接近理想擴(kuò)增效率（90%～110%）。在FFPE樣本中，組織特異性miRNA和5S rRNA的擴(kuò)增效率較高，與凍存樣本類似；而管家基因mRNA的擴(kuò)增效率與產(chǎn)物長(zhǎng)度有關(guān)，GAPDH-S和ACTB-S的擴(kuò)增效率較為理想，但GAPDH-L和ACTB-L擴(kuò)增效率較差。

圖2 凍存腦組織miR-125b的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 各指標(biāo)的擴(kuò)增效率

2.3 內(nèi)參指標(biāo)篩選

在各組織樣本中選取理想擴(kuò)增效率的RNA指標(biāo)作為候選內(nèi)參指標(biāo)，分別為：miR-125b、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（腦組織）；miR-1、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（心肌組織）；miR-122、5S rRNA、GAPDH-S及ACTB-S（肝組織）。運(yùn)用Ref-Finder軟件對(duì)上述指標(biāo)的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到各指標(biāo)的綜合穩(wěn)定度排序?yàn)椋耗X組織中，ACTB-S＞5S rRNA＞miR-125b＞GAPDH-S；心肌組織中，5S rRNA＞ACTB-S＞miR-1＞GAPDH-S；肝組織中，5S rRNA＞miR-122＞GAPDH-S＞ACTB-S。其中，5S rRNA在各組織中穩(wěn)定性都相對(duì)較高，故選為本研究?jī)?nèi)參指標(biāo)。

2.4 定量表達(dá)情況分析

對(duì)各RNA指標(biāo)Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理（ΔCt=Ct指標(biāo)-Ct5SrRNA），并以1號(hào)凍存樣本（PMI為6 h）為對(duì)照，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各指標(biāo)在凍存樣本和FFPE樣本中的相對(duì)表達(dá)量。以腦組織ACTB-S為例，其在不同樣本中的相對(duì)表達(dá)量如圖4所示，結(jié)果表明，同一組織凍存樣本和FFPE樣本中ACTB-S的相對(duì)表達(dá)量高度相關(guān)（r=0.945，P＜0.05），證實(shí)其在FFPE樣本中能有效擴(kuò)增，且其平均相對(duì)表達(dá)量（0.721±0.239）與凍存樣本（0.795±0.232）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 ACTB-S在腦組織凍存和FFPE樣本中的表達(dá)情況

相應(yīng)的，各RNA指標(biāo)在各組織凍存和FFPE樣本中的平均相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。

在各組織凍存樣本中（特別是肝組織），GAPDHL和ACTB-L的相對(duì)表達(dá)量均略低于其對(duì)應(yīng)的短擴(kuò)增產(chǎn)物的GAPDH-S和ACTB-S，進(jìn)一步證實(shí)隨PMI延長(zhǎng)RNA降解增加、完整性下降。在FFPE樣本中，GAPDH-L和ACTB-L的相對(duì)表達(dá)量較凍存樣本顯著下降，表明經(jīng)FFPE處理后RNA降解明顯；但是擴(kuò)增產(chǎn)物較短的GAPDH-S、ACTB-S及各組織特異性miRNA（miR-125b、miR-1和miR-122）的表達(dá)情況與凍存樣本相比下降不明顯。

圖5 各RNA指標(biāo)在凍存和FFPE樣本中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

FFPE組織樣本是法醫(yī)病理學(xué)研究和實(shí)踐中重要的材料來(lái)源，具有來(lái)源充足、可長(zhǎng)期保存、疾病類型較多、病理信息豐富等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，RNA（特別是小分子miRNA）在死亡原因分析、PMI推斷及損傷時(shí)間推斷等方面的作用也受到法醫(yī)學(xué)者的重視，因此，如能在FFPE樣本中提取到高質(zhì)量的RNA，并準(zhǔn)確定量及獲取相關(guān)基因表達(dá)信息，對(duì)于上述研究具有重要的科研價(jià)值。近年來(lái)，隨著RNA提取技術(shù)的進(jìn)步和商業(yè)化試劑盒的更新，已有研究[12]證實(shí)在FFPE樣本中可有效提取RNA，并能通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)各類RNA的表達(dá)情況，甚至還可進(jìn)行高通量分析。此外，法醫(yī)學(xué)尸檢組織均經(jīng)過(guò)一定的PMI，而PMI對(duì)新鮮（凍存）組織及其對(duì)應(yīng)FFPE樣本的影響也值得探究。已有研究[8，13]證實(shí)，F(xiàn)FPE樣本中RNA的質(zhì)量與甲醛固定時(shí)間和樣本保存時(shí)間有關(guān)，因此，為了對(duì)比不同PMI的凍存及同一組織FFPE樣本中RNA的質(zhì)量，并分析管家基因mRNA及ncRNA的定量表達(dá)情況，本研究中各樣本固定時(shí)間與保存時(shí)間均是一致的。

提取所得總RNA的質(zhì)量檢測(cè)一般分為濃度、純度與完整性3項(xiàng)。與前期多數(shù)研究[14-15]一致，在FFPE樣本中提取所得到的RNA濃度低于對(duì)應(yīng)凍存樣本，但可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)用量。純度分析結(jié)果表明，從所有樣本中提取得到的RNA純度均較高，可用于下游反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。完整性分析采用RIN表示，在凍存樣本中，RIN值隨PMI延長(zhǎng)而下降，證實(shí)RNA隨PMI延長(zhǎng)會(huì)發(fā)生不同程度的降解，導(dǎo)致完整性下降。此外，同一案例中，心肌、腦組織的RIN值均高于肝組織，表明肝組織中RNA較易降解，與前期研究[16]結(jié)果一致。與凍存樣本相比，F(xiàn)FPE樣本RNA的完整性相對(duì)較低，表明RNA均發(fā)生不同程度降解導(dǎo)致完整性下降，分析與甲醛引起RNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)及化學(xué)修飾有關(guān)[17-18]。因此，運(yùn)用RT-qPCR對(duì)FFPE樣本中各RNA指標(biāo)進(jìn)行定量分析時(shí)，一定要按照標(biāo)準(zhǔn)的流程進(jìn)行。

本研究RT-qPCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照MIQE指南[19]（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）進(jìn)行，包括標(biāo)準(zhǔn)化的RNA提取、gDNA去除、選取同樣量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線檢驗(yàn)引物特異性、定量PCR反應(yīng)3次重復(fù)、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增效率及篩選內(nèi)參指標(biāo)等，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。為了更好地分析mRNA和ncRNA在FFPE樣本中的表達(dá)情況，除常用管家基因GAPDH和ACTB外，本研究還選擇了3種分別在腦、心肌及肝組織中特異性表達(dá)的miRNA及常用的內(nèi)參指標(biāo)5S rRNA，上述指標(biāo)均具有一定的代表性。此外，本研究還對(duì)管家基因mRNA指標(biāo)設(shè)計(jì)了不同擴(kuò)增片段的引物，以進(jìn)一步探究各組織樣本中RNA的降解程度及產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)定量結(jié)果的影響。

RT-qPCR結(jié)果表明，除GAPDH-L和ACTB-L在PMI較長(zhǎng)（45h及70h）的FFPE樣本中未檢出外，其余RNA指標(biāo)均成功擴(kuò)增并獲得Ct值，但是不同RNA指標(biāo)的擴(kuò)增效率在凍存樣本和FFPE樣本中有差異。凍存樣本中各RNA指標(biāo)的擴(kuò)增效率都較為理想，而FFPE樣本中GAPDH-L和ACTB-L的擴(kuò)增效率較差，這一方面與PCR受到抑制有關(guān)[15，20]，另一方面也表明FFPE樣本中RNA發(fā)生了不同程度的碎片化，片段較小的miRNA及產(chǎn)物長(zhǎng)度較短的mRNA指標(biāo)可有效擴(kuò)增[9，21]。

RT-qPCR定量分析結(jié)果的可靠性與內(nèi)參指標(biāo)密切相關(guān)，為了篩選出在所有樣本均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參指標(biāo)，本研究運(yùn)用能綜合分析的RefFinder工具進(jìn)行篩選，結(jié)果表明5S rRNA在所有樣本中綜合穩(wěn)定度最高，其表達(dá)水平也與各因素?zé)o關(guān)，是理想的內(nèi)參指標(biāo)。之后，對(duì)各候選RNA指標(biāo)進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理，以準(zhǔn)確定量各指標(biāo)在凍存樣本和FFPE樣本中的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)表達(dá)情況與其擴(kuò)增效率有一致性，擴(kuò)增效率接近理想的RNA指標(biāo)，其定量結(jié)果在兩組樣本中也高度相關(guān)（如腦組織的ACTB-S，r=0.945）。與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果[14-15，22]一致，擴(kuò)增產(chǎn)物較長(zhǎng)的管家基因GAPDH-L和ACTB-L在FFPE樣本中的表達(dá)量顯著降低，表明FFPE樣本中長(zhǎng)鏈線性RNA的碎片化是不可避免的；而擴(kuò)增產(chǎn)物較短的mRNA指標(biāo)（GAPDH-S和ACTB-S）及小分子miRNA，相對(duì)不受PMI及FFPE處理的影響，在兩組樣本中表達(dá)具有一致性。

綜上所述，盡管FFPE組織樣本中的RNA會(huì)發(fā)生不同程度的降解和碎片化，但通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的RT-qPCR、選取合適的RNA指標(biāo)及設(shè)計(jì)合適產(chǎn)物長(zhǎng)度的引物，可有效地在組織樣本中對(duì)管家基因RNA和miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，并能在一定程度上反映相關(guān)基因的真實(shí)表達(dá)水平。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及擴(kuò)充指標(biāo)選擇范圍，并探討不同固定時(shí)間及保存條件下FFPE樣本中RNA的質(zhì)量及定量表達(dá)水平。