邢冠潤(rùn)，郎芯蕊，吳吉安，樓洪興，劉文強(qiáng)，張恒碩，董信陽(yáng)，潘曉亮，王友明*

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310012；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江杭州 310021）

在高密度養(yǎng)殖條件下，產(chǎn)蛋雞尤其在產(chǎn)蛋后期更易受多種應(yīng)激影響，引發(fā)生產(chǎn)性能下降、發(fā)病率升高等一系列問(wèn)題，應(yīng)用抗生素曾經(jīng)是解決該問(wèn)題的很好手段。但近年來(lái)美國(guó)及西歐一些國(guó)家相繼禁用或限用抗生素作為飼料添加劑，我國(guó)2015 版《中國(guó)獸藥典》及農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部”）1435、1506 公告已經(jīng)明令禁止部分抗生素在蛋雞生產(chǎn)中的使用。因此，抗生素替代技術(shù)的研究備受關(guān)注，如在日糧中添加微生態(tài)制劑、植物提取物、中草藥制劑、酶制劑等，以及采用營(yíng)養(yǎng)抗病技術(shù)、改變光照、加強(qiáng)消毒免疫等手段。凝結(jié)芽孢桿菌既具有維持腸道微生態(tài)平衡、刺激免疫、提高機(jī)體健康水平、促進(jìn)消化等優(yōu)點(diǎn)，又具有抗逆性強(qiáng)、可定植等生物特性[1]，是安全飼料添加劑研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，蛋雞日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌具有促進(jìn)蛋雞生產(chǎn)性能的作用[2-4]，但對(duì)其可能影響蛋雞產(chǎn)蛋性能機(jī)制的研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)探究在飼糧中添加不同水平的凝結(jié)芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋雞后期的生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性、生殖激素水平及相關(guān)受體基因表達(dá)量的影響，探究其可能的作用機(jī)制，為今后凝結(jié)芽孢桿菌制劑在蛋雞上的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 凝結(jié)芽孢桿菌制劑（菌株WS4-1 獲得中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心的菌保號(hào)CGMCCNO.7023），經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所測(cè)定，本批次產(chǎn)品（批次號(hào)：2017091501）含凝結(jié)芽孢桿菌3.12×1011CFU/g 及其代謝產(chǎn)物，芽孢形成率85.2%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 選取648 羽66 周齡健康、體重、產(chǎn)蛋率基本一致的“京粉1 號(hào)”蛋雞，隨機(jī)分為4 個(gè)組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)27 羽。對(duì)照組飼喂無(wú)抗基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在無(wú)抗基礎(chǔ)料中添加3.33×106、1×107、3.33×107CFU/g 凝結(jié)芽孢桿菌。試驗(yàn)于2018 年4 月21 日—6 月22 日在海鹽縣葉盛禽業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，預(yù)試期1 周，飼喂基礎(chǔ)日糧，正試期8 周。

無(wú)抗基礎(chǔ)飼糧結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，同時(shí)參照美國(guó) NRC（1994）蛋雞營(yíng)養(yǎng)需要配制，配方組成和主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。蛋雞采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每天恒定光照16 h，自然通風(fēng)，由專人飼養(yǎng)。飼喂量：前4 周·110 g/（d·只），后4 周112 g/（d·只），自由飲水，每天13:30 飼喂，15:00 收蛋，消毒、免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。

表1 無(wú)抗基礎(chǔ)日糧組成和主要營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 采樣與保存 試驗(yàn)結(jié)束次日進(jìn)行屠宰采樣，隨機(jī)從每組中選取大小基本一致的蛋雞12 只 （每個(gè)重復(fù)2 只） 空腹稱重（斷料12 h），頸動(dòng)脈放血，待析出血清后3 000 r/min 離心10 min 分離血清，再分裝在離心管中，并于-20℃冰箱保存。取卵巢并盡量剔除大部分卵泡后置于凍存管中-80℃保存。十二指腸、空腸、回腸中段靠后1 cm 處各取0.5 g 左右黏膜，置于1.5 mL 的離心管中，-80℃冷凍保存待用。取樣稱重并記錄脾臟、肝臟、心臟、胰臟、卵巢的重量。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 每天定時(shí)記錄各重復(fù)組的產(chǎn)蛋數(shù)、合格蛋重，計(jì)算產(chǎn)蛋率、平均合格蛋重、料蛋比。

產(chǎn)蛋率=產(chǎn)蛋數(shù)/試驗(yàn)雞數(shù)×100%

平均合格蛋重=合格蛋總重/（產(chǎn)蛋數(shù)－破蛋數(shù)－軟殼蛋數(shù)）

料蛋比=日采食量/日產(chǎn)平均合格蛋重

1.4.2 器官指數(shù) 計(jì)算脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、胰臟指數(shù)、卵巢指數(shù)等。器官指數(shù)計(jì)算公式：

器官指數(shù)=器官重（g）/宰前活重（kg）

1.4.3 血清生化指標(biāo) 測(cè)定指標(biāo)包括總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（Glob）、白球比（A/G）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（Glu）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、鈣（Ca）、磷（P）、尿素（Urea）。采用全自動(dòng)生化分析儀（OLYMPUSAU5421+ISE 型，日本OLYMPUS 公司）測(cè)定，于杭州市第二人民醫(yī)院完成。

1.4.4 小腸黏膜消化酶活性 取小腸黏膜0.1 g 左右，加入4℃生理鹽水0.9 mL，加入鋼珠充分勻漿，將勻漿液在4℃ 3 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液分裝與1.5 mL 的Eppendorf 管中待測(cè)。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性及組織蛋白濃度采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.4.5 血清生殖激素及卵巢受體基因表達(dá)量 血清促卵泡素（FSH）、促黃體生成素（LH）采用ELISA 試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，試劑的配制和操作嚴(yán)格按說(shuō)明書步驟進(jìn)行。雌二醇（E2）在杭州市第二人民醫(yī)院完成測(cè)定。

促黃體生成素受體（LHR）及血清促卵泡素受體（FSHR）和18S RNA（內(nèi)參基因）的引物由委托寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成。稱取50～100 mg 卵巢樣品，采用RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bioer）進(jìn)行總RNA 提取及cDNA 合成。對(duì)樣品的cDNA 和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性：50.0℃，2 min；95.0℃10 min。PCR 反應(yīng)：95.0℃，10 s；60℃，30 s；采集熒光信號(hào)，共 40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：60℃升至 95.0℃，60℃保溫 1 min，95℃保溫15 s，自動(dòng)采集熒光。1.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因子方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)?；虮磉_(dá)量采用 2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌制劑對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和器官指數(shù)的影響 由表2 可知，試驗(yàn)Ⅰ組產(chǎn)蛋率較對(duì)照組相比提高了2.03%（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組平均合格蛋重較對(duì)照組降低了0.64%（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組料蛋比校對(duì)照組降低2.26%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組脾臟指數(shù)提高了104.76%（P＜0.05）；4 組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、卵巢指數(shù)無(wú)顯著差異。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響 由表3可知，相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組ALP 分別提高11.58%、11.53%、19.29%（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組TG 分別降低16.40%、13.67%（P＜0.05），3 個(gè)試驗(yàn)組的Ca 分別提高7.11%、5.58%、5.25%（P＜0.05）；相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組Urea 均降低7.94%（P＜0.05）。飼糧中添加不同水平凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)血清TP、ALB、Glob、A/G、Glu、P、TC 均無(wú)顯著影響。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響 由表4 可知，相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組十二指腸淀粉酶比活力分別提高了65.63%、34.38%、25.00%（P＜0.05），十二指腸脂肪酶比活力分別提高了28.03%、56.48%、43.34%（P＜0.05）， 十 二 指 腸蛋白酶比活力分別提高了14.27%、42.58%、27.93%（P＜0.05）。相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組空腸淀粉酶比活力分別提高了37.90%、65.32%、77.42%（P＜0.05），空腸脂肪酶比活力分別提高了36.37%、59.14%、40.18%（P＜0.05），空腸蛋白酶比活力分別提高了14.69%、52.53%、29.12%（P＜0.05）。相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組回腸淀粉酶比活力分別提高了24.00%、60.00%（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組回腸脂肪酶比活力分別提高了33.85%、53.24%、40.11%（P＜0.05），回腸蛋白酶比活力分別提高了24.05%、39.12%、28.70%（P＜0.05）。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能及器官指數(shù)的影響

表3 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響（n=12）

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生殖激素和卵巢FSHR、LHR mRNA 表達(dá)量的影響 由表5 可知，相比對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組FSH 分別提高14.74%、25.69%、14.74%（P＜0.05），E2分 別 提 高6.96%、8.17%、14.22%（P＜0.05）。各試驗(yàn)組的血清LH 水平有提高趨勢(shì)（P＞0.05）。各試驗(yàn)組的卵巢FSHR mRNA 表達(dá)量隨著劑量的升高呈先上升后下降的變化特點(diǎn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別提高53.27%、58.88%、54.21%（P＜0.05）。LHR mRNA 的表達(dá)量變化規(guī)律與FSHR mRNA 類似，但各組間差異不顯著。

3 討 論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和器官指數(shù)的影響 本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加適量的凝結(jié)芽孢桿菌可提高蛋雞產(chǎn)蛋率和降低料蛋比；可顯著提高蛋雞的脾臟指數(shù)，對(duì)心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、胰臟指數(shù)有提高趨勢(shì)。趙必遷等[2]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高產(chǎn)蛋高峰期的產(chǎn)蛋率，降低破蛋率。黃遵錫等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著降低不合格蛋率，降低料蛋比。陳曉帥等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在肉鴿飼糧中添加復(fù)合益生菌提高了乳鴿的脾臟指數(shù)、心臟指數(shù)。趙娜等[6]研究結(jié)果顯示，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可提高免疫器官指數(shù)，降低死淘率。這可能是由于凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)可大量繁殖，不斷合成有益物質(zhì)，可作為抗原刺激免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育，適度提高蛋雞免疫水平[7]，從而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響 本試驗(yàn)中，在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高血清中ALP、Ca、P 含量，顯著降低血清中TG、Urea 含量，對(duì)TP、ALB、Glob、A/G、Glu 含量均有提高作用，TC 含量有降低趨勢(shì)。林麗花等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在黃羽肉雞飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)血清中TP、ALB、ALP 含量均有提高作用。黃世猛等[9]報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌能降低蛋雞血清TG 和TC 含量，促進(jìn)蛋雞Ca、P 的消化吸收。以上研究結(jié)果提示，凝結(jié)芽孢桿菌具有加強(qiáng)蛋白質(zhì)合成代謝[10]，降低分解代謝的作用，改善腸道健康，提高Ca、P 吸收，為蛋雞生產(chǎn)性能的提高提供營(yíng)養(yǎng)保證，從而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響（n=12）

表5 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生殖激素水平和卵巢FSHR 、LHR mRNA 表達(dá)量的影響（n=12）

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞小腸黏膜消化酶比活力的影響 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞小腸黏膜淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶比活力?？锶旱萚11]研究表明，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高武昌魚的蛋白酶活力、蛋白質(zhì)利用效率和生長(zhǎng)率。曾麗莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高肉鴨十二指腸淀粉酶活性和胰蛋白酶活性。這可能由于凝結(jié)芽孢桿菌可產(chǎn)生乳酸降低腸道pH，產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶類和酶促因子，降解果膠、葡聚糖、纖維素等復(fù)雜的碳水化合物[13-15]，提高腸道中消化酶的比活力，改善機(jī)體消化功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而提高蛋雞生產(chǎn)性能。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞血清生殖激素及卵巢受體基因表達(dá)量的影響 本試驗(yàn)研究表明，添加不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌顯著提高了FSH 和E2的濃度，對(duì)LH 有提高趨勢(shì)；卵巢LHR mRNA 和FSHR mRNA 的表達(dá)量與LH 和FSH 呈相同的變化規(guī)律。Lei 等[16]報(bào)道，地衣芽孢桿菌能提高蛋雞血清FSH 和E2含量。丁陽(yáng)等[17]研究認(rèn)為，血清FSH 含量與卵巢FSHR mRNA、LHR mRNA 表達(dá)量呈較強(qiáng)的正相關(guān)。該菌可能是通過(guò)提高機(jī)體代謝、蛋白合成、調(diào)控激素分泌等途徑，使卵巢生殖系統(tǒng)更加健康，促進(jìn)卵巢上繁殖相關(guān)受體基因表達(dá)，從而對(duì)卵巢上卵泡發(fā)育造成影響，進(jìn)而提高其產(chǎn)蛋性能。

4 結(jié) 論

凝結(jié)芽孢桿菌制劑可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，提高蛋雞生產(chǎn)性能。凝結(jié)芽孢桿菌提高蛋雞生產(chǎn)性能的主要機(jī)理：①適當(dāng)提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的免疫力、消化能力，進(jìn)而改善血清生化指標(biāo)，提高蛋白合成能力。②促進(jìn)性腺激素釋放和卵巢上繁殖相關(guān)受體基因表達(dá)。