羅永光

（淮安生物工程高等職業(yè)學校，江蘇淮安 223200）

蘆?。≧utin）又稱蕓香苷，是維生素P 的主要成分。蘆丁是一種從植物中提取的黃酮類化合物，其結構是由槲皮素 C3 位上的羥基和蕓香糖結合而形成的雙糖苷[1]。蘆丁具有抗炎、抑菌、抗病毒和抗氧化等作用，目前廣泛應用于防治腦溢血、高血壓、關節(jié)炎等疾病。在飼料中添加黃酮類化合物可促進畜禽生長、提高生產性能和改善繁殖性能等[2]。有研究表明，在日糧中添加適量的蘆丁能夠提高奶牛泌乳性能，保持乳品質，降低奶牛血清中尿素氮的水平和抑制甲烷的生成，提高血清溶菌酶的含量以及通過提高瘤胃內容物固相和液相濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶的活性來提高奶牛的消化和代謝[3-6]。另外，蘆丁能夠提高大鼠泌乳量，促進免疫器官胸腺和脾臟的發(fā)育[7-8]。以上表明，作為黃酮類物質的蘆丁可以作為一種綠色添加劑在動物生產中應用。目前，關于蘆丁對奶牛乳腺上皮細胞影響的研究未見報道，蘆丁提高奶牛泌乳性能的機制尚不清楚。因此，本實驗以體外細胞培養(yǎng)法來研究蘆丁對奶牛乳腺上皮細胞的影響，為豐富相關理論提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蘆?。ê俊?8 %）由上海源葉生物科技有限公司提供，奶牛乳腺上皮細胞通過組織塊培養(yǎng)法獲得，胎牛血清和DMEM/F12 購于美國的Gibco 公司，青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺購于美國的Sigma 公司，二甲基亞砜（DMSO）購于北京的索萊寶公司，RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒購于天根生化有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將采集到的奶牛乳腺用含有雙抗的PBS 進行清洗，然后根據(jù)李吉霞[9]的方法進行組織塊培養(yǎng)法獲得乳腺上皮細胞。將純化的細胞接種在含有10% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺等的DMEM/F12 培養(yǎng)基中， 37℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活性 采用噻唑藍（MTT）法進行細胞活性的檢測，將細胞密度調整到1×105個/mL 后接種到96 孔板中，分別在基礎培養(yǎng)基中分別加0、25、50、100、150 μg/mL蘆丁（溶于二甲基亞砜，二甲基亞砜含量為1‰），每組5 個重復。細胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h和96 h 后，分別在每孔中加入20 μL 0.5% MTT，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去除培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2 遍，每孔加入DMSO 150 μL 于搖床混勻10 min，最后在490 nm 下測定OD 值。

1.2.3 抗氧化指標的測定 將細胞密度調整到1.5×105個/mL接種到12 孔板，分組同1.2.2，每組4 個重復。細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 和96 h 后，然后參照南京建成試劑盒上的方法檢測乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。

1.3 細胞凋亡基因表達的測定

1.3.1 RNA 的提取 將細胞密度調整到5×105個/mL 接種到12 孔板，分組同1.2.1，每組4 個重復。細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后，棄除培養(yǎng)基，在6 孔板中加入1 mL 的RZ 裂解液裂。RNA 的提取方法參照試劑盒中的說明書，提取的RNA 經(jīng)過濃度和純度的檢測后進行反轉錄，操作方法參照試劑盒中的說明書。將cDNA 保存在-20℃冰箱待測。

1.3.2 RT-PCR 條 件 反 應 體 系 為 20 μL：Master Mix (2×) 10 μL，上、下游引物 (10×)各1 μL，cDNA 5 μL，無酶水3 μL。反應條件為95℃ 預變性10 min；PCR 反應為95℃、10 s，退火60℃和72℃延伸各10 s，循環(huán)45 次；融解曲線分析65℃、60 s。

1.3.3 引物設計 根據(jù)GenBank 中的基因序列設計引物，由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，β-actin 為管家基因。引物設計見表1。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)先用Excle 2010 預處理，然后采用IBM SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），LSD 法進行多重比較，結果以平均值± 標準差表示， P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蘆丁對乳腺上皮細胞活性的影響 由表2 可知，48 h時，100 μg/mL 和150 μg/mL 蘆丁組的細胞活性顯著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 蘆丁組，而在96 h 時，50～150 μg/mL蘆丁組的細胞活性顯著高于0 μg/mL 蘆丁組。結果說明，蘆丁能夠促進細胞的增殖，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。

2.2 蘆丁對乳腺上皮細胞抗氧化性指標的影響 由表3 可知，48 h 時，100 μg/mL 蘆丁組細胞的GSH-Px 和CAT活性顯著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 蘆丁組，0 μg/mL 蘆丁組的MDA 含量和LDH 活性均顯著高于其他各組，而各組的SOD 活性沒有顯著差異；在96 h 時，0 μg/mL 蘆丁組的GSH-Px 活性和SOD 活性顯著低于100 μg/mL和150 μg/mL 蘆丁組，而MDA 含量和LDH 活性均顯著高于100 μg/mL 蘆丁組，50 μg/mL 蘆丁組的CAT 活性顯著高于其他組，150 μg/mL 蘆丁組CAT 活性最低。結果表明，蘆丁能夠提高抗氧化酶活性，進而提高細胞的抗氧化能力，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。2.3 蘆丁對乳腺上皮細胞凋亡基因表達的影響 由表4可知，100 μg/mL 蘆丁組乳腺上皮細胞的Bcl-2 表達顯著高于其他組，其他各組之間差異不顯著；0 μg/mL 蘆丁組細胞的Caspase3 表達顯著高于其他組，100 μg/mL和150 μg/mL 蘆丁組細胞的P53 表達顯著低于其他組。結果表明，蘆丁能夠通過影響凋亡相關基因的表達來抑制細胞的凋亡，其中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最好。

3 討 論

劉春龍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加10、100 ng/mL 染料木素和添加100、1 000 ng/ mL 大豆黃酮均能夠顯著促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖。穆瑩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，添加10～1 000 mg/L 大豆異黃酮能顯著增強奶牛乳腺上皮細胞增殖能力與活力。另外，苜蓿黃酮也能夠促進體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的增殖[12]。以上結果表明，黃酮類化合物能夠促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖。本實驗中，細胞培養(yǎng)48 h 和96 h 時，添加100～150 μg/mL 蘆丁均能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細胞的活性?？梢娞砑舆m量的蘆丁能夠促進奶牛乳腺上皮細胞增殖。蘆丁的結構與內源性雌激素17-β-雌二醇相似，能夠與雌激素受體競爭性地結合，發(fā)揮弱雌激素效應，進而升高生長激素、胰島素樣生長因子和催乳素水平，促進乳腺發(fā)育并提高產奶量[13]。因此，蘆丁促進奶牛乳腺上皮細胞增殖可能與它發(fā)揮弱雌激素作用有關。

表1 引物設計

表2 蘆丁對乳腺上皮細胞活性（OD 值）的影響

表3 蘆丁對乳腺上皮細胞抗氧化指標的影響

表4 蘆丁對乳腺上皮細胞相關基因表達的影響

盧志勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞SOD、GSH-Px 和 CAT 活性，降低MDA、NO 含量。王振云等[15]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可能通過降低 MDA 含量，增強 SOD 活性來保護奶牛乳腺上皮細胞氧化應激損傷。蘇效雙等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加苜蓿黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞GSH-Px 和 CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。本實驗也發(fā)現(xiàn)，添加100 μg/mL 蘆丁能提高奶牛乳腺上皮細胞的GSHPx 、SOD 和CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。結果說明，添加適量的蘆丁能夠提高細胞的抗氧化性能。蘆丁作為一種黃酮類化合物，可能從以下幾方面來發(fā)揮抗氧化作用：①在氧化過程中，釋放H+直接能夠與自由基相結合，進而清除自由基；②與金屬離子螯合，降低金屬離子誘導產生的氧自由基；③抑制脂肪氧合酶、NADH 氧化酶等氧化酶的活性，降低超氧化陰離子的產生[16]。

Caspase 3 被認為是凋亡的關鍵蛋白酶，當其被激活時必然會發(fā)生細胞凋亡，因此發(fā)生細胞凋亡時，會先活化Caspases 蛋白酶，進而介導蛋白裂解。Bcl-2 基因是一種具有抑制凋亡的癌基因，能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，從而抑制了細胞凋亡。P53 作為抑癌基因之一，是細胞內的轉錄因子，在正常狀態(tài)下其表達較低。P53 通過激活細胞凋亡受體Fas、Bax、Noxa、Puma、Apaf-1 以及線粒體膜上的Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1 等凋亡相關基因的轉錄來誘導細胞凋亡。張錦等[17]研究蘆丁對H2O2誘導心肌細胞凋亡的作用發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠通過上調Bcl-2 蛋白的表達，下調Bax 蛋白的表達，進而發(fā)揮抗氧化作用，抑制細胞凋亡。王麗偉等[18]發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠通過上調Bcl-2 蛋白的表達，下調Bax 蛋白的表達和抑制Caspase 3 蛋白的活化來發(fā)揮對心肌細胞的保護。研究發(fā)現(xiàn)，葛根異黃酮能夠下調甲基-苯基-吡啶離子誘導的帕金森病細胞模型P53 mRNA 的表達；在1-甲基-4-苯基-吡啶離子的誘導下，葛根素能夠通過下調人神經(jīng)母細胞瘤細胞的P53 mRNA 的表達來保護細胞[19-20]。以上結果說明，黃酮類化合物能夠通過調控Bcl-2、Caspase 3 和P53 的表達來保護細胞。本研究也發(fā)現(xiàn)，添加100 μg/mL 蘆丁能夠上調Bcl-2 的表達和下調P53 和Caspase 3 的表達。另外，添加100 μg/mL蘆丁組的細胞活性最高。結果說明，添加適量的蘆丁能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。

有些黃酮類化合物不僅能夠保護DNA 免受氧化損傷，但也能誘導DNA 損傷。黃酮是否促氧化性還是抗氧化性，主要取決于黃酮的濃度。另外，金屬離子是黃酮表現(xiàn)抗氧化性還是促氧化性的一個重要因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加量大于100 μg/mL 蘆丁組細胞活性、細胞內抗氧化酶活性均有所下降，促細胞凋亡基因的表達有所增加。說明添加高劑量蘆丁對細胞的增殖有負面作用。原因可能是高濃度的蘆丁螯合金屬離子數(shù)量多，進入細胞后釋放出的金屬離子表現(xiàn)出促氧化的作用，進而導致細胞產生自由基，促進細胞凋亡，降低細胞活性。

4 結 論

蘆丁能夠通過提高細胞的抗氧化能力和抑制細胞凋亡來提高奶牛乳腺上皮細胞的活性。從本實驗條件下，培養(yǎng)基中添加100 μg/mL 蘆丁的效果最佳。