讓鳳菊 任艷利 張維 歐陽艷

（1. 伊犁師范大學新疆維吾爾自治區(qū)教育廳天然產(chǎn)物化學與應用重點實驗室，伊寧 835000；2. 伊犁師范大學生物與地理科學學院，伊寧 835000）

當今，從藥用植物中篩選生物活性成分或先導化合物成為研制新藥的有效途徑之一，但人類對藥用植物需求量日益增大，致使許多藥用植物開采過度，瀕臨滅絕。植物內(nèi)生菌的出現(xiàn)為藥用植物新資源的研究開拓了一條新思路［1]。近年研究顯示，內(nèi)生菌不僅具有促進植物體的生長，抗菌、抗病蟲害等功能，還能參與植物次生代謝成分的轉(zhuǎn)化合成，甚至獨立合成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物［2]。因此，利用植物資源分離和篩選產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，用于生產(chǎn)新型活性物質(zhì)，以期研制高效、環(huán)保的新藥，即可解決某些藥用植物生長緩慢，資源緊缺等引起的藥源匱乏，耐藥致病菌的發(fā)生等問題，還可保護植物生態(tài)，開發(fā)植物內(nèi)生菌資源。

伊犁野核桃屬胡桃科（Juglan daceae）山核桃屬（Carya）落葉喬木，屬典型的藥、食兩用植物。生長于天山支脈北坡植物生長緩慢，資源緊［3]，屬國家二級保護的野生植物。核桃屬植物中主要含有黃酮類、蒽醌類、酚類等多種化學成分［4]，具有抗腫瘤、抑菌及抗氧化等活性作用［5]。近年關(guān)于伊犁野核桃內(nèi)真菌生物學方面［6-7]研究備受關(guān)注，而對伊犁野核桃內(nèi)生真菌研究未見報道。本實驗以伊犁野核桃研究對象，分離其內(nèi)生真菌并對高活性菌株鑒定，以期為伊犁野核桃新的藥用資源的利用供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 野核桃采自鞏留縣野核桃溝，經(jīng)生物系張維教授鑒定為伊犁野核桃。

1.1.2 供試菌株 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、番茄灰霉菌（Bontrvtis cinerea）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄固體培養(yǎng)基（PDA）；察氏培養(yǎng)基；核桃汁培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，野核桃葉浸提液200 mL，加水定容至1 000 mL。

1.1.4 主要試劑 無水乙醇、Tris堿、Tris-HCI、CTAB、氯仿、異戊醇、瓊脂糖等分析純試劑均購于天津福晨化學試劑廠，DPPH購于長城生物化學工程有限公司。

1.1.5 儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀：美國伯樂公司，HT30；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備；超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠，Y-2000型；高速冷凍離心機HC-3018R：安徽中科中佳科學儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀C-1000TM均購于美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 伊犁野核桃內(nèi)生真菌的分離及保存 把野核桃根、莖、葉、果皮、果仁切成約1 cm×0.5 cm的組織塊，依次用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，8%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗3次，分別接種到PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和核桃浸提液培養(yǎng)基（各加入1‰青霉素和鏈霉素，抑制細菌的生長）中，最后一遍無菌水涂布于空白培養(yǎng)基，檢驗植物表面是否消毒徹底。28℃培養(yǎng)3-7 d，待材料邊緣長出菌絲后，菌絲尖端接種法接至新PDA培養(yǎng)基，2-3次純化后，每菌轉(zhuǎn)接3支斜面培養(yǎng)基（其中一支用甘油封存，長期保存），于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性篩選

1.2.2.1 初篩瓊脂塊法［8]（1）病原細菌的檢測 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，150 r/min培養(yǎng)12 h，用無菌水稀釋至最終濃度為106CFU/mL。取100 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，用打孔器取直徑0.5 cm內(nèi)生真菌菌餅，均勻接種于培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)12 h后，測定供試菌株的抑菌圈大小，每種重復3次。（2）供試菌株的檢測 采用兩點對峙實驗［9]測定內(nèi)生真菌對供試菌株的抑制作用，將已活化的內(nèi)生真菌和病原真菌接種于同一個 90 mm PDA平板中，2個接種點中心對稱，相距40 mm，每組處理重復3次。于28℃下恒溫培養(yǎng)。對照組不接種內(nèi)生真菌，測定處理組供試菌株菌落生長半徑和對照組病原菌生長半徑。采用公式（1）計算供試真菌生長抑制率。

其中，r對照為對照組供試菌株菌落生長半徑，單位mm；r處理為處理組供試菌株菌落生長半徑單位為mm。

1.2.2.2 復篩-濾紙片擴散法［10]（1）待測菌株發(fā)酵液制備 將初篩的13株內(nèi)生真菌，分別接種于盛有200 mL PDL培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于28℃，150 r/min培養(yǎng)2周左右，用8層紗布過濾，將真菌發(fā)酵液濃縮至原體積的1/3，加入等體積乙酸乙酯超聲萃取3次，每次20 min，合并乙酸乙酯萃取液，40℃減壓蒸干，用少量甲醇重新溶解，繼續(xù)減壓旋蒸約1.5 mL，過0.22 μm的濾膜后，定容至2 mL，菌株發(fā)酵液，4℃冰箱備用。（2）發(fā)酵液抑菌活性測試 用移液槍取8 μL發(fā)酵液于滅菌濾紙片，微風吹干，置于放有病原菌的平板，每個板3個重復，同時以甲醇作空白對照，分別置于28℃和37℃培養(yǎng)，十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.2.3 發(fā)酵物抗氧化能力的檢測 對13種抑菌活性較好的野核桃內(nèi)生真菌進行抗氧化測試，取一定濃度真菌發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液進行DPPH自由基清除實驗，篩選高抗氧化活性菌株［11]

1.2.4 野核桃內(nèi)生真菌的5.8S rDNA基因序列分析 選取抑菌活性較強內(nèi)生真菌，采用CTAB法提取活性菌株DNA模板［12]。選通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務公司測序。將菌株的ITS序列信息輸入GenBank進行BLAST分析，MEGA軟件聚類分析，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育數(shù)，再結(jié)合形態(tài)根據(jù)《真菌鑒定手冊》［13]對菌株進行初步鑒定。

2 結(jié)果

2.1 野核桃內(nèi)生真菌的分離

從野核桃中共分離純化到49株內(nèi)生真菌（表1），其中PDA培養(yǎng)基得內(nèi)生真菌27株，核桃汁培養(yǎng)基比較少，14株，察氏培養(yǎng)基僅8株。由表1知，分離出的野核桃內(nèi)生真菌數(shù)量在各組織中分布有差別：莖＞根＞葉＞果皮＞果仁，莖分離的最多（24株），占總數(shù)的48.75%，根次之22.45%，果仁和內(nèi)果皮兩次都沒有分離到內(nèi)生菌。

表1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果統(tǒng)計

2.2 內(nèi)生真菌對供試菌株抑菌活性初篩

首先用瓊脂塊法進行初篩。前人研究表明，抑菌活性分為弱：抑菌圈直徑d≤1 cm；較強：1 cm＜d＜1.4 cm；強：d＞1.4 cm三個等級（真菌：抑制率 ≥ 75%為強，抑菌率為 50%-75%較強拮抗能力，抑制率 ＜50% 為弱）［14]。

由表2知49株野核桃內(nèi)生真菌中50%以上的菌株對3種指示細菌抑菌性較強，表明野核桃內(nèi)生真菌對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜抑菌性。其中有41株內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌抑菌作用顯著，達83.67%；而對供試真菌的抑菌活性相對較弱，其中有2株對油菜菌核菌表現(xiàn)抑菌作用較強，占總數(shù)的4.08%，而對番茄灰霉抑菌作用弱。

表2 四十九株野核桃內(nèi)生真菌對5種供試菌株的拮抗作用

2.3 內(nèi)真生菌的乙酸乙酯萃取液對供試菌株的抑菌性實驗

對初篩的13株內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液進行抑菌實驗（表3，圖1），結(jié)果顯示：（1）大部分內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液與其瓊脂塊抑菌效果一致，但個別內(nèi)生真菌的瓊脂塊與其萃取液抑菌效果差異大，如YHT-12的瓊脂塊抑菌直徑均大于1.4 cm，其萃取液的抑菌直徑均小于1.4 cm，可能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，或者是萃取液處理過程使其失活可進一步研究。（2）不同內(nèi)生真菌對4種供試菌株抑制效果差別較大，其中YHT-6和YHT-4最為突出，抑菌指數(shù)均大于10，對3種指示細菌的抑菌直徑都大于1.4 cm，對油菜核盤菌抑菌率大于50%；（3）不同內(nèi)生真菌對同一病原菌抑制效果也不同，其中對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)抑制作用的菌株數(shù)量最大，13株內(nèi)生菌中有12株對其有抑制作用，抑菌響應指數(shù)達33。對油菜核盤菌的抑制效果較差，抑菌響應指數(shù)僅為10。

表3 十三株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取液對4種供試菌株的抑制作用

圖1 野核桃內(nèi)生真菌YHT-4菌株和乙酸乙酯萃取液抑菌圖

2.4 野核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵液對DPPH自由基清除實驗結(jié)果

清除DPPH自由基模型是一種應用廣泛的快速評估抗氧化活性的方法，由圖2知，13株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液對DPPH自由基清除能力差異明顯，大多數(shù)菌株的乙酸乙酯萃取液對DPPH·PPH·能力差異明顯，大多數(shù)菌株8株內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液清除率超過50%，菌株YHT-4的乙酸乙酯萃取液對DPPH·PPH·萃取液達93.82%，接近Vc（95.95%）；而菌株YHT-43的EFFEA對DPPH·的清除率最低，為21.42%?？梢?，半數(shù)以上野核桃內(nèi)生真菌具有良好的清除DPPH·自由基能力，菌株YHT-4抗氧化活性較強。

圖2 野核桃菌株發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液對DPPH自由基的清除率

2.5 抑菌活性菌株YHT-4的鑒定

菌株YHT-4具有較強的抑菌、抗氧化能力，且遺傳性狀穩(wěn)定，對其培養(yǎng)鑒定。由圖3可見，菌株YHT-4在PDA培養(yǎng)基上生長良好，于28℃培養(yǎng)6 d后，其菌落直徑接近9 cm，菌落厚而突起，生長較快，菌絲初生白色長而蓬松，后期菌落中部變?yōu)榉凵?，菌落邊緣白色，不?guī)則；菌絲分枝，有隔，孢子無色，多孢，略彎，兩端稍尖。參照《真菌鑒定手冊》發(fā)現(xiàn)菌株YHT-4與鐮刀菌（Fusarium tricinctum）的形態(tài)特征相似。

由測序結(jié)果知，內(nèi)生真菌YHT-4的PCR擴增的DNA片段為524 bp，提交至GenBank得登錄號為MH754650，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，內(nèi)生真菌YHT-4在鐮刀菌屬中的遺傳距離與Fusarium tricinctum在一個分枝上，即兩者遺傳距離最近，故初步判斷菌株YHT-4為屬于Fusarium tricinctum（三線鐮刀菌）。

圖3 菌株YHT-4顯微照片

圖4 菌株YHT-4系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

3 討論

植物內(nèi)生真菌在長期進化過程中與宿主植物形成共生互利關(guān)系。實驗證明，內(nèi)生真菌可產(chǎn)生具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等與宿主植物相似活性的代謝產(chǎn)物。因此，植物內(nèi)生真菌為尋找安全新型藥提供了潛在的資源［15-16]。本研究從伊犁野核桃各組織中共分離出內(nèi)生真菌49株，通過抑菌和抗氧化測試篩選出一株具有較強的抑菌和抗氧化性活性菌株YHT-4，其對4種供試菌株具有較強抑制作用，抑菌指數(shù)均大于10，抑菌直徑大于1.4 cm；同時，對DPPH·的清除率達93.82%，接近Vc（95.95%）；最后該菌株被鑒定為三線鐮刀屬。菌株YHT-4展現(xiàn)出一定的開發(fā)價值，表明伊犁野核桃的內(nèi)生真菌中蘊含豐富的抑菌抗氧化菌株資源。

據(jù)統(tǒng)計，鐮刀屬真菌廣泛分布于植物體內(nèi)和土壤中，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等生物活性。鐮刀菌屬為栽培核桃的優(yōu)勢內(nèi)生真菌屬［17]，劉澤星等［14]從栽培核桃分離出鐮刀菌的發(fā)酵產(chǎn)物含有較多的活性物質(zhì)，具有廣泛的抑菌活性。Tiwari等［18]研究顯示，從毛姜黃分離出的內(nèi)生真菌中，鐮刀菌具有較好的抗氧化活性。

有研究表明，三線鐮刀菌在特定條件下代謝產(chǎn)生T-2毒素，T-2毒素可對人和動物的多個組織器官包括血液、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性效應［19]。近年實驗報道，T-2毒素可明顯抑制某些腫瘤細胞的增殖并誘發(fā)細胞凋亡。Wu等［20]報道了當T-2毒素作用于人宮頸癌HeLa細胞時最終誘導細胞凋亡?？梢姡m然T-2毒素具有一定毒性，也因此展現(xiàn)了在腫瘤治療中潛在的應用價值。因此需要進一步確定菌株YHT-4 的抗氧化及抑菌活性成分，并對其使用安全性進一步評價。

4 結(jié)論

本實驗采用組織塊法從伊犁野核桃中分離到49株內(nèi)生真菌，通過抑菌活性篩選，得到抑菌活性菌株YHT-4，其發(fā)酵液對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌的抑菌直徑均大于1.4 cm，對油菜核盤菌的抑菌率達70.92%；其清除DPPH自由基能力與Vc相當。形態(tài)學與分子學鑒定為三線鐮刀菌。