劉宇程 邱戀 梁晶晶 李玲麗 馬麗麗，2

（1. 西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，成都 610500；2. 南開大學(xué)環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350）

聚丙烯酰胺（Polyacrylamide，PAM）以其相對(duì)高分子量、高黏度的特性，在石油工業(yè)、水處理、造紙業(yè)和化學(xué)工業(yè)等具有廣泛的應(yīng)用［1-3]，其中石油行業(yè)是我國(guó)PAM使用量最大的領(lǐng)域［4]。PAM作為三次采油的驅(qū)油劑注入地下后，產(chǎn)生大量含有高濃度聚合物的產(chǎn)出水，嚴(yán)重影響了后續(xù)油水分離過程［5]。雖然PAM本身無毒，但其單體丙烯酰胺能損傷人和動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)［6]。

PAM在水環(huán)境中的遷移和積累對(duì)生物及人體健康具有潛在影響，因此亟待開展PAM的高效降解研究［7]。微生物降解是自然環(huán)境中有機(jī)污染物完全礦化的主要方法。微生物可通過利用或合成酶類、非蛋白質(zhì)類和胞外其他物質(zhì)等分解PAM［8-9]。PAM可作為氮源被微生物利用［10]。PAM也可作為碳源進(jìn)行微生物生長(zhǎng)［11-12]。本實(shí)驗(yàn)從受PAM污染的污泥中篩選出一株能以PAM作為唯一碳、氮源的降解菌株，研究了該菌株的降解特性，相關(guān)結(jié)果可以為受PAM污染環(huán)境的修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試劑 菌種來源：陜蒙交界地區(qū)的大牛地油田含聚丙烯酰胺污泥。聚丙烯酰胺：分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠，分子量3×103kD。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，調(diào)pH為7?；A(chǔ)培養(yǎng)基：聚丙烯酰胺，酵母浸粉0.05 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，瓊脂15 g/L（固體培養(yǎng)基），調(diào)pH為7。富集培養(yǎng)基：聚丙烯酰胺0.3 g/L，酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L（固體培養(yǎng)基），調(diào)pH為7。聚合物培養(yǎng)基：聚丙烯酰胺1.2 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，pH為7。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L（固體培養(yǎng)基），調(diào)pH為7。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 降解菌株的馴化及分離 取3 g污泥樣品接種于100 mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，在30℃、140 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，富集污泥中微生物。后取5 mL菌液接種于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其中PAM濃度按梯度依次為0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、1.8 g/L和2.0 g/L逐漸增大，在相同條件下培養(yǎng)7 d后吸取5 mL馴化液轉(zhuǎn)接到新的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，馴化周期為7 d，連續(xù)馴化3個(gè)周期后，分別吸取1 mL菌液涂布到富集培養(yǎng)基平板上，30℃下倒置培養(yǎng)24 h-48 h，挑取平板上長(zhǎng)出的不同菌落進(jìn)行劃線純化，保存分離菌株。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的前提下，去掉酵母浸粉，分別加入葡萄糖、氯化銨和不加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配置出限制氮源培養(yǎng)基、限制碳源培養(yǎng)基、限制營(yíng)養(yǎng)源培養(yǎng)基。

1.2.2 菌株鑒定 將純化后菌液均勻涂在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)24 h-48 h后，選擇分布適中的單菌落進(jìn)行觀察：大小與形狀、隆起、邊緣、表面、硬度、透明度等。

使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取菌株DNA，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGTTACGACTT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃下預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，53℃退火90 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果經(jīng)NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，挑選相關(guān)序列，采用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 PAM濃度的影響 將聚合物培養(yǎng)基中PAM的濃度依次調(diào)整為 0.3 g/L、0.6 g/L、1.2 g/L、2.4 g/L、3.6 g/L、4.8 g/L、7.2 g/L和9.6 g/L。將挑選出的菌種接種至培養(yǎng)基中，放入搖床中（30℃，140 r/min）震蕩培養(yǎng)48 h后，分別測(cè)定細(xì)菌濃度和PAM降解率。利用淀粉-碘化鎘測(cè)定PAM濃度［13]。

1.2.4 培養(yǎng)溫度的影響 將菌種接種至聚合物培養(yǎng)基中，分別在20、25、30、35和40℃水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，140 r/min，震蕩培養(yǎng)48 h后，分別測(cè)定細(xì)菌濃度和PAM降解率。

1.2.5 培養(yǎng)基初始pH的影響 將聚合物培養(yǎng)基初始 pH 值分別調(diào)節(jié)為 3.5、4.5、5.5、6.8、7.5、8.5 和 9.5，并接種菌種至培養(yǎng)基中，放入搖床（35℃，140 r/min）震蕩培養(yǎng)48 h后，分別測(cè)定細(xì)菌濃度和PAM降解率。

1.2.6 降解曲線的測(cè)定 在上述所測(cè)量的最適PAM初始濃度和pH基礎(chǔ)上，PCX接種到以PAM為唯一營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基中，放入搖床（35℃，140 r/min）震蕩培養(yǎng)48 h后，分別測(cè)定細(xì)菌濃度和PAM降解率。

1.2.7 PAM降解產(chǎn)物分析 將降解后的培養(yǎng)液6 000 r/min離心5 min，棄沉淀保留上清液，然后上清液和無水乙醇以1∶2體積比震蕩混合均勻，靜置10 min后以3 000 r/min離心15 min，收集沉淀。沉淀物真空干燥后即得待測(cè)樣品。凝膠滲透色譜測(cè)定降解產(chǎn)物的分子量，采用安捷倫PLGPC220色譜分析儀，以四氧呋喃（THF）為流動(dòng)相，測(cè)定樣品的分子量。利用傅里葉變換-紅外光譜儀對(duì)PAM及其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，分析波長(zhǎng)介于400-4 000 cm-1之間。本實(shí)驗(yàn)采用費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri NRRL B-11177）測(cè)定聚丙烯酰胺降解產(chǎn)物的生物急性毒性，利用發(fā)光細(xì)菌分析儀BioFix?Lumi-10測(cè)定細(xì)菌光強(qiáng)度的變化，用SPSS軟件的Probit工具計(jì)算PAM降解產(chǎn)物的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。

2 結(jié)果

2.1 降解菌株的分離篩選

從分離菌株中篩選出3株菌，分別命名為PCS、PCX、PW，為了研究3株菌對(duì)PAM的利用，將3種細(xì)菌的菌懸浮液分別接種到限制氮源培養(yǎng)基、限制碳源培養(yǎng)基、限制營(yíng)養(yǎng)源（碳源、氮源）培養(yǎng)基。當(dāng)PAM作為唯一氮源時(shí)，如圖1所示，PCS、PCX、PW對(duì)PAM的降解率分別為42%、37%和31%，普遍高于PAM為碳源和PAM為唯一營(yíng)養(yǎng)源的降解效果；同時(shí)3株降解菌的細(xì)菌濃度分別為2.13×108CFU/mL、2.69×108CFU/mL、2.44×108CFU/mL，同樣高于PAM為碳源和PAM為唯一營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基。當(dāng)PAM作為唯一碳源和唯一碳、氮源時(shí)僅剩菌株P(guān)CX生長(zhǎng)情況最好，細(xì)菌濃度大于108CFU/mL，對(duì)PAM的降解率仍大于30%，因此選擇PCX作為后期實(shí)驗(yàn)菌種。

圖1 PAM為碳源、氮源、同時(shí)為碳氮源條件下3株菌的降解率

2.2 優(yōu)勢(shì)降解菌PCX的鑒定

由菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌菌落形態(tài)特性呈現(xiàn)為：圓形、乳白色、有光澤、整齊、光滑及不透明；個(gè)體形態(tài)特性為：短桿狀、革蘭氏染色G-、無芽孢和無莢膜。進(jìn)一步通過對(duì)PCX的16S rDNA檢 測(cè) 發(fā) 現(xiàn)：PCX的16S r DNA序列（GenBank登錄號(hào) MK571603），與Klebsiellasp.NBRC 100048（登錄號(hào)AB681138.1）有99.9%的相似度；根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用NCBI提供的Blast工具，經(jīng)過16S rDNA測(cè)序及同源性對(duì)比，通過MEGA 5.5鄰接法（Neighbour-joiningmethod，NJ）構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，因此鑒定菌株P(guān)CX為克雷伯氏桿菌屬。

圖2 降解菌PCX基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 菌株P(guān)CX的降解特性

2.3.1 PAM濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 如圖3所示，當(dāng)PAM初始濃度在1.2 g/L時(shí)，培養(yǎng)48 h后，PCX對(duì)PAM的降解率最高，達(dá)到35%。但當(dāng)PAM 的濃度大于3 g/L時(shí)，PAM的降解率受到抑制，基本低于20%。

圖3 PAM濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解率的影響

2.3.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)降解效果和菌體的生長(zhǎng)的影響如圖4所示。在20-35℃條件下，隨著溫度的升高，PAM的降解率升高。在35℃時(shí)，PCX生長(zhǎng)狀況和降解效率最好，分別達(dá)到了2.44×108CFU/mL和43%。因此選取35℃作為PCX的最適培養(yǎng)溫度。

圖4 溫度對(duì)降解的影響

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 如圖5所示，初始pH值的不同對(duì)PAM溶液中的PCX的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響，同時(shí)過高或過低的pH值都不利于PAM的降解，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的菌株P(guān)CX，適宜降解PAM的pH值范圍是5.0-7.0，最適pH為7.0。

2.3.4 PAM的降解曲線 PCX接種到以PAM為唯一營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基中，隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線和降解曲線，如圖6所示。PCX在接種后2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，菌體數(shù)量不斷增加，PAM降解率也隨之明顯升高，說明PCX能以PAM作為唯一營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)，同時(shí)使得PAM發(fā)生降解。培養(yǎng)40 h后細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌代謝產(chǎn)物不斷積累，細(xì)菌繁殖速度下降，PAM降解率趨于平緩，降解率達(dá)43%左右。

圖5 初始pH值對(duì)降解的影響

圖6 降解菌PCX的降解曲線

2.4 降解產(chǎn)物的分子量變化

聚丙烯酰胺經(jīng)過降解菌PCX降解后的產(chǎn)物的凝膠色譜結(jié)果如表1所示，降解產(chǎn)物的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和峰位分子量（Mp）分別為0.602 kD、0.647 kD和0.619 kD。聚丙烯酰胺降解前的分子量為3×103kD，表明在微生物的作用下，PAM主碳鏈發(fā)生斷裂，被降解成為小分子物質(zhì)。

2.5 降解產(chǎn)物的紅外光譜分析

對(duì)微生物降解前后的PAM進(jìn)行了紅外光譜分析，如圖7所示，與生物降解前PAM樣品的光譜中的峰相比，生物降解后的PAM樣品的光譜中的C=O伸縮振動(dòng)峰由1 665 cm-1移動(dòng)到更高波數(shù)的位置1 672 cm-1處，2 925 cm-1為亞甲基反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，2 854 cm-1為亞甲基對(duì)稱伸縮振動(dòng)的特征吸收峰。紅外光譜分析表明C-N伸縮振動(dòng)峰（降解前吸收峰在1 405 cm-1處）和N-H彎曲振動(dòng)（降解前吸收峰在1 452 cm-1處）消失，3 300-3 500 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)變成了一個(gè)寬大的吸收峰，表明PAM的酰胺基從PAM主鏈上剝落并被微生物利用，酰胺基通過微生物的降解完全轉(zhuǎn)化為羧基。

表1 PAM降解產(chǎn)物的凝膠色譜測(cè)定結(jié)果

圖7 PAM降解前后的紅外光譜圖

2.6 PAM降解產(chǎn)物的生物急性毒性評(píng)價(jià)

半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）是導(dǎo)致發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生50%變化時(shí)的測(cè)試樣品的濃度。用SPSS軟件計(jì)算PAM降解產(chǎn)物的生物急性毒性，軟件分析結(jié)果表明聚丙烯酰胺降解產(chǎn)物在30 min內(nèi)對(duì)費(fèi)希爾弧菌的EC50為106 mg/L，其95%置信區(qū)間為28-489。根據(jù)歐盟指令（Directive93/67/EEC）給出的化學(xué)品水生生物急性毒性分類規(guī)則，降解產(chǎn)物的半數(shù)致死濃度大于100 mg/g無毒性［14]，可以判定克雷伯氏菌降解PAM的產(chǎn)物對(duì)水生生物無毒害作用，表明降解產(chǎn)物中可能無丙烯酰胺單體。

3 討論

從若干分離菌株中篩選出3株菌（PCS、PCX和PW），PAM作氮源時(shí)，降解菌的生長(zhǎng)狀況和對(duì)PAM的降解率普遍優(yōu)于PAM做碳源和PAM為唯一營(yíng)養(yǎng)源時(shí)；說明PAM更易于被微生物作為氮源利用。但對(duì)于PAM來說，只有當(dāng)它作為碳源被利用時(shí)才更有利于聚合物的解鏈和徹底降解。在本研究中當(dāng)菌株生長(zhǎng)在限制碳源和限制營(yíng)養(yǎng)源培養(yǎng)基中時(shí)，菌株P(guān)CX生長(zhǎng)情況最好，細(xì)菌濃度大于108CFU/mL，對(duì)PAM的降解率仍大于30%，說明該菌株可以將PAM既作為氮源又作為碳源而進(jìn)行利用。

PCX對(duì)PAM的適宜濃度是1.2-2.4 g/L，當(dāng)培養(yǎng)基中PAM濃度較高時(shí)，體系的黏度也會(huì)上升，影響PCX菌體的擴(kuò)散，同時(shí)PAM自身的絮凝、架橋作用使得微生物更難利用［15-16]。在高PAM濃度下，PCX需要更長(zhǎng)的時(shí)間來適應(yīng)環(huán)境。相反地，當(dāng)PAM 的濃度低于1.2 g/L時(shí)，PCX菌體的增殖速率略緩，最終菌體數(shù)量較低。溫度對(duì)PAM降解率的影響較大。隨著培養(yǎng)溫度上升使酶促反應(yīng)加快，有助于菌株P(guān)CX的代謝生長(zhǎng)，利于微生物對(duì)底物PAM的降解［17]。不同的微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和生理、生化過程中，最適宜的pH值也不同［18]。pH在5.0-7.0范圍內(nèi)，還原酶、胞外酰胺酶活性最好，對(duì)于底物的利用率最高，從而對(duì)PAM的降解效果最好［19-20]。

通過對(duì)PAM降解產(chǎn)物的生物急性毒性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，降解產(chǎn)物對(duì)水生生物無毒害作用。紅外光譜分析表明聚丙烯酰胺在降解菌PCX的作用下，酰胺基已經(jīng)轉(zhuǎn)化為羧基被PCX作為氮源利用。PAM可同時(shí)被降解菌PCX作為碳源和氮源加以利用，將其分解代謝為小分子物質(zhì)?？死撞暇鷮僭诮到饩郾０肪酆衔锷暇哂幸欢ǖ膽?yīng)用前景，為后續(xù)處理難降解聚合物提供新的思路。

4 結(jié)論

本研究從聚丙烯酰胺污染的污泥中初步篩選出3株好氧的PAM降解菌種，其中PCX在限制碳源和氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況最好，對(duì)PAM的降解率達(dá)到了43%。PCX的形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rDNA序列鑒定的結(jié)果表明，PCX為克雷伯氏菌屬，命名為Klebsiella sp. PCX。