胡笑峰 張朵朵 周云橫 衛(wèi)亞紅 陳少林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 旱區(qū)生物質(zhì)能研究中心，楊凌 712100）

木質(zhì)素是地球上數(shù)量最多的芳香族聚合物［1]，與纖維素、半纖維素共同組成木質(zhì)纖維素。木質(zhì)纖維素是目前生物質(zhì)能源可研究和利用的主要材料。作為一種可再生能源，生物質(zhì)的開發(fā)利用是解決目前人類能源危機(jī)的重要途徑之一，但是天然纖維質(zhì)原料的木質(zhì)化很大程度上限制了其可利用性［2]。在地球碳循環(huán)中，木質(zhì)素降解處于中心地位，因?yàn)榇蠖鄶?shù)碳或者存在于木質(zhì)素中，或者存在于受木質(zhì)素保護(hù)免受酶降解的纖維素和半纖維素中［3]，所以木質(zhì)素能否順利降解也極大地影響著纖維素的有效利用。此外，木質(zhì)素作為一種造紙工業(yè)的副產(chǎn)物，由于很難被降解，排放到環(huán)境中后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的水生態(tài)污染［4]。相較于傳統(tǒng)的物理轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化，開發(fā)低能耗、清潔度高和對(duì)環(huán)境友好的生物法降解木質(zhì)素正成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。白腐真菌是木質(zhì)素降解中最主要的微生物，對(duì)其木質(zhì)素降解，產(chǎn)酶條件的優(yōu)化等方面的研究是目前生物技術(shù)應(yīng)用的熱點(diǎn)［5-6]。然而，細(xì)菌具有來(lái)源廣、生長(zhǎng)快、便于工程改造且易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，因此，細(xì)菌降解木質(zhì)素的研究也具有廣闊的前景。本研究利用選擇培養(yǎng)基初步篩選具有木質(zhì)素降解功能的細(xì)菌，通過(guò)16S rRNA基因序列分析鑒定菌株，進(jìn)一步明確了菌株QL-Z3具有以堿木質(zhì)素為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝的木質(zhì)素潛在降解性能。并對(duì)其相關(guān)酶學(xué)展開研究，為具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的木質(zhì)素生物降解技術(shù)的開發(fā)提供途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 供試土壤采樣地位于秦嶺西部的辛家山林區(qū)（海拔：1 500-2 000 m；經(jīng)緯度：106°E，34°N），土樣采集點(diǎn)的植物群落為華山松，采樣深度為0-10 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）菌種活化培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH為7.0-7.2）。（2）液體木質(zhì)素培養(yǎng)基：堿木質(zhì)素 3 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.08 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，MnCl20.02 g/L，KH2PO41 g/L，蛋白胨2 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L。自然pH。（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BM培養(yǎng)基）：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH為7.0左右。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選鑒別［7]稱取5.0 g土壤樣品于100 mL液體木質(zhì)素培養(yǎng)液中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將各培養(yǎng)液從10-1稀釋至10-6，吸取0.1 mL涂布于木質(zhì)素培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，再次于木質(zhì)素培養(yǎng)基平板劃線純化。挑取純化后的單菌落經(jīng)液體擴(kuò)大培養(yǎng)后按1∶1的體積比加入50%甘油，混勻后保存于-80℃冰箱。取-80℃保藏的菌株經(jīng)過(guò)LB培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，使用Bacterial DNA Kit（Omega）提取總DNA，以總DNA為模板，使用27F/1492R通用引物進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。根據(jù)電泳條帶有無(wú)，挑選其中陽(yáng)性克隆菌落，送西安擎科生物工程公司測(cè)序。將序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)BLAST，用MEGA6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷菌株所屬類別［8]。

1.2.2 菌株的生長(zhǎng)測(cè)定 將QL-Z3菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為1.2左右，5 000 r/min離心菌體5 min，用生理鹽水洗滌2次后懸浮，取菌液按1%的接種量接種于液體木質(zhì)素培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)培養(yǎng)液離心前后在600 nm處的吸光度差值來(lái)反應(yīng)菌株的生長(zhǎng)狀況：

第n小時(shí)的OD600=OD600a-OD600b

OD600a：培養(yǎng)液在600 nm吸光度直接測(cè)定值；OD600b：培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心5 min后上清液在600 nm吸光度測(cè)定值。

1.2.3 木質(zhì)素降解率的測(cè)定 280 nm處的吸光度作為木質(zhì)素濃度測(cè)定指標(biāo)［9]：

第n小時(shí)木質(zhì)素降解率（%）=（A0-An）/A0×100 A0：接菌前培養(yǎng)基中木質(zhì)素的濃度；An：接菌培養(yǎng)n小時(shí)后培養(yǎng)基中木質(zhì)素的濃度。

1.2.4 木質(zhì)素降解酶的定性檢測(cè)［10-11]采用苯胺蘭（Azure-B）和RB亮藍(lán)（Remazol brilliant blue）染料平板檢測(cè)，在BM培養(yǎng)基中分別加入0.1 g/L的染料苯胺蘭和RB亮藍(lán)，鋪平板后接種菌株，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察，以平板培養(yǎng)基中菌落周圍脫色圈的有無(wú)來(lái)定性檢測(cè)木質(zhì)素降解酶是否產(chǎn)生。

1.2.5 木質(zhì)素酶活力的定量測(cè)定方法 （1）木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的測(cè)定［12]：反應(yīng)體系為3 mL，反應(yīng)混合液含有1.85 mL 0.24 mmol/L藜蘆醇和1.0 mL粗酶液，預(yù)熱至37℃后加入，0.1 mL 6.0 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，并測(cè)定3 min前后在310 nm下吸光度值的增加量。一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘使1 μmol藜蘆醇氧化所需要的酶量。（2）漆酶的測(cè)定［13]：在25℃ 3 mL反應(yīng)體系中，反應(yīng)混合液含有2 mL 0.5 mmol/L的ABTS（溶于0.1 mmol/L，pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中），加入1 mL粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，每隔1 min 測(cè)定420 nm下的吸光值，取吸光值線性變化部分，一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化1 μmol ABTS所需要的酶量。（3）錳過(guò)氧化物酶的測(cè)定［13]：在37℃ 3 mL反應(yīng)體系，反應(yīng)混合液含有2.4 mL 50 mmol/L pH 4.5的醋酸緩沖液，0.1 mL 1.6 mmol/L MnSO4溶液，0.4 mL粗酶液，37℃下加入0.1 mL 1.6 mmol/L的H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定最初3 min內(nèi)在240 nm下吸光度值并取線性變化部分。一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘使1 μmol Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量（以上定量測(cè)定試驗(yàn)均做3次重復(fù)）。

1.2.6 粗酶液的制備［14]液體木質(zhì)素培養(yǎng)基中30℃搖瓶培養(yǎng)的菌液8 000 r/min離心10 min所得的上清液即為粗酶液。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）觀察［15]分別取30℃、180 r/min培養(yǎng)3 d和7 d的未接菌（空白對(duì)照）和QL-Z3接種量為1%的木質(zhì)素培養(yǎng)液50 mL，12 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)液氮速凍后放入真空冷凍干燥儀中干燥至恒重，干燥后的樣品噴金后進(jìn)行電鏡掃描觀察。

2 結(jié)果

2.1 菌株QL-Z3的菌種鑒定

將菌株QL-Z3的16S rRNA基因序列與NCBI中現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取結(jié)果中相似度最高的屬作為對(duì)應(yīng)菌株分類標(biāo)準(zhǔn)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可知，菌株QL-Z3的16S rRNA基因序列與登錄號(hào)為AM055711的歐文氏菌屬菌株Erwinia billingiaeEb661相似度最高，為99%，因此鑒定菌株QL-Z3為歐文氏菌，命名為Erwiniasp. QL-Z3。該菌株GenBank登錄號(hào)MH828331；在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株保藏編號(hào)為CGMCC 1.16623。

2.2 菌株QL-Z3的生長(zhǎng)及木質(zhì)素的降解

由圖2可以看出，菌株Erwiniasp.QL-Z3能在以木質(zhì)素為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在發(fā)酵48 h后，菌株的生長(zhǎng)量達(dá)到最大，OD600達(dá)到0.31。此外，結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò)72 h培養(yǎng)后，培養(yǎng)液在280 nm處的吸光度由初始1.90降為1.63。這意味著在經(jīng)過(guò)72 h的發(fā)酵，14.23%的木質(zhì)素被菌株QL-Z3降解。

圖2 菌株生長(zhǎng)曲線和木質(zhì)素降解曲線

2.3 菌株QL-Z3酶活的定性及定量檢測(cè)

2.3.1 定性檢測(cè) 木質(zhì)素的降解主要是依賴一系列酶的共同作用［16]，這些酶主要包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidases，LiP）、錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidases，MnP）和漆酶（Laccase，Lac）。苯胺藍(lán)的脫色與LiP及MnP的產(chǎn)生有關(guān)，但不反映漆酶的產(chǎn)生，漆酶能使RB亮藍(lán)脫色。結(jié)果如圖3所示。菌株Erwinia sp. QL-Z3對(duì)苯胺藍(lán)有較強(qiáng)的脫色能力，對(duì)RB亮藍(lán)有一定的脫色作用。根據(jù)平板的脫色結(jié)果，表明在無(wú)木質(zhì)素誘導(dǎo)物存在的情況下菌株Erwinia sp. QL-Z3具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的能力，但據(jù)苯胺藍(lán)和RB亮藍(lán)平板脫色反應(yīng)只能簡(jiǎn)單判斷菌株的產(chǎn)酶情況，要具體確定菌株的木質(zhì)素降解能力，需進(jìn)行木質(zhì)素降解酶活的定量測(cè)定試驗(yàn)。

圖3 菌株Erwinia sp.QL-Z3脫色情況

2.3.2 定量測(cè)定 圖4為該菌株分泌3種胞外酶的能力，從圖4中可以看出，QL-Z3具有較強(qiáng)的錳過(guò)氧化物酶分泌能力，在前2 d酶活增加較快，且在60 h達(dá)到最大值263.83 U/L，隨后降低。然而分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的能力相對(duì)較弱，漆酶在培養(yǎng)48 h后達(dá)到了最高酶活，僅有77 U/L，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶也在第48小時(shí)達(dá)到最大值104.11 U/L，隨后緩慢降低。這3種酶的合成均是在菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期內(nèi)，且酶活變化趨勢(shì)與菌株QL-Z3在木質(zhì)素培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律基本一致。

圖4 木質(zhì)素降解過(guò)程中QL-Z3 酶活曲線

2.4 掃描電鏡（SEM）分析

利用掃描電鏡觀察木質(zhì)素降解過(guò)程中的形貌變化，是目前證明木質(zhì)素能否被微生物修飾或降解的重要技術(shù)手段之一［17]，將木質(zhì)素樣品在Erwinia sp.QL-Z3降解前后的形態(tài)放大相同的倍數(shù)后，可以看出未經(jīng)細(xì)菌處理的木質(zhì)素樣品（圖5-A）結(jié)構(gòu)致密且呈塊狀，而經(jīng)Erwinia sp. QL-Z3處理3 d后的樣品（圖5-B）結(jié)構(gòu)呈疏松多孔狀，經(jīng)Erwinia sp. QL-Z3處理7 d后的樣品（圖5-D）結(jié)構(gòu)疏松多孔更為明顯。通過(guò)對(duì)比圖5-A、5-B、5-C、5-D可證明菌株Erwinia sp. QL-Z3能夠?qū)δ举|(zhì)素樣品進(jìn)行解聚，破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使其裂解成細(xì)小的碎片。

3 討論

由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作為世界上第二豐富的可再生有機(jī)資源卻一直未被充分利用。研究者們對(duì)木質(zhì)素綜合利用方法的探索已進(jìn)行了幾十年，然而仍存在許多問(wèn)題，如化學(xué)法易造成二次污染，物理法能耗過(guò)高，而生物法雖對(duì)環(huán)境友好，但也存在效率低的問(wèn)題。目前普遍存在的燃燒或者廢棄木質(zhì)素的做法會(huì)極大地浪費(fèi)能源并污染環(huán)境，因此篩選高效降解木質(zhì)素的微生物具有現(xiàn)實(shí)意義，這不僅充分利用了廢棄物，而且對(duì)開發(fā)以木質(zhì)纖維素為原料的生物質(zhì)能源也具有重要意義。

圖5 木質(zhì)素樣品掃描電鏡圖

目前，國(guó)內(nèi)外研究歐文氏菌主要集中在病原菌的研究，著重關(guān)注其致病性的較多。如Hirakawa等［18]研究了Erwiniacarotovora在植物液泡細(xì)胞死亡過(guò)程中的作用；Antonio等［19]研究了植物對(duì)Erwinia amylovora致病性產(chǎn)生適應(yīng)性的原因。近幾十年來(lái)，木質(zhì)素的微生物降解研究主要集中于白腐真菌和褐腐真菌等真菌的研究上［20]，同時(shí)，也有越來(lái)越多的研究者從森林土壤或造紙廢水中篩選鑒定出能降解木質(zhì)素的細(xì)菌，如Streptomyces griseorubensAG-11［21]、Sphingomonas paucimobilisSYK-6［22]、Bacillusspp.［23]、Klebsiellasp. BRL6-2［24]、Rhodococcus jostiiRHA1［25]，這些研究表明，細(xì)菌在生物多樣性和環(huán)境適應(yīng)性等方面比真菌更具優(yōu)勢(shì)。木質(zhì)素降解機(jī)制十分復(fù)雜，在降解途徑上，許多研究者基于試驗(yàn)結(jié)果提出了相關(guān)的推測(cè)，如Shi等［26]在細(xì)菌菌株Cupriavidus basilensisB-8中推測(cè)出β-Ketoadipate代謝途徑、苯酚降解途徑和龍膽酸代謝途徑。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)苯甲酸代謝途徑是木質(zhì)素降解過(guò)程中的主要代謝途徑，主要存在于細(xì)菌中［27]?？傊?，盡管對(duì)于細(xì)菌降解木質(zhì)素機(jī)制已經(jīng)有了大量的推測(cè)性研究［28-29]，但由于細(xì)菌的種類不同，其代謝途徑也不完全相同，且此類研究不夠系統(tǒng)，尚未完整系統(tǒng)地描述細(xì)菌中木質(zhì)素的降解途徑和代謝機(jī)制。因此，建立模式細(xì)菌，利用成熟的組學(xué)技術(shù)和先進(jìn)分析手段，構(gòu)建細(xì)菌降解木質(zhì)素的完整代謝途徑是急需解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象Erwiniasp. QL-Z3是一株從土壤中分離到的細(xì)菌，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株能將木質(zhì)素作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并且能分泌Lip、Mnp和Lac等3種重要的木質(zhì)素降解酶，具備對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行解聚，破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的能力。這表明該菌株在將來(lái)生物質(zhì)能源利用及木質(zhì)素污染的環(huán)境治理方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于歐文氏菌降解木質(zhì)素的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分離得到菌株Erwiniasp. QL-Z3并證明其木質(zhì)素降解性能，可豐富木質(zhì)素降解的細(xì)菌種類并為尋找降解利用木質(zhì)素的微生物提供備選菌株，從而為開發(fā)利用以木質(zhì)纖維素為主要來(lái)源的生物質(zhì)能源提供更多選擇。

4 結(jié)論

本研究從森林土壤樣品中分離得到一株具備木質(zhì)素降解潛力的菌株QL-Z3，經(jīng)鑒定屬于歐文氏菌屬（GenBank登錄號(hào)MH828331；中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)CGMCC 1.16623）。該菌株能夠利用堿木質(zhì)素為唯一碳源生長(zhǎng)，定性和定量檢測(cè)均表明該菌株具備分泌木質(zhì)素降解酶的能力，并且通過(guò)對(duì)木質(zhì)素的解聚可使木質(zhì)素形貌發(fā)生改變。在以堿木質(zhì)素為唯一碳源的液體堿木質(zhì)素培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，OD600達(dá)到0.31，發(fā)酵72 h，木質(zhì)素降解率為14.23%。木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力在發(fā)酵48 h和60 h達(dá)到峰值：發(fā)酵60 h Mnp達(dá)到263.83 U/L，發(fā)酵48 h Lip和Lac分別達(dá)到104.11 U/L和77 U/L。本研究較為系統(tǒng)地揭示了Erwinia屬菌株的木質(zhì)素降解性能，該菌株可作為木質(zhì)素降解的優(yōu)良備選菌株。