郭宇澤 丁雪敏 姚嵐 許德敏 趙雨潔 馮福應(yīng) 孟建宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

合理育苗可使所培育幼苗苗壯、根系發(fā)達(dá)、移栽不緩苗和生長快等而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛?；|(zhì)是決定育苗成功與否的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)的育苗基質(zhì)只起提供營養(yǎng)、保水和固定支撐等作用［1]。目前，我國育苗基質(zhì)質(zhì)量和水平還有待提高，而添加植物生長促生微生物可能是有效措施和途徑之一［2]。但相關(guān)研究和實(shí)踐較少。僅有的少量研究表明，添加植物根際促生細(xì)菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）—芽孢桿菌（如解淀粉芽孢桿菌 SQR9）等可顯著提高番茄等的育苗效果［2-4]。PGPR 所包括的細(xì)菌類群很多［5]，但除芽孢桿菌外其它類群的細(xì)菌尚未見用于植物育苗的研究報(bào)道。

馬西利亞屬（Massilia）是在 1998 年提出的一個(gè)新菌屬，其模式菌株Massilia timonae為分離自人體血液的Massilia timonaeCIP 105350T［6]。而近年來，從許多植物根際也發(fā)現(xiàn)了馬西利亞屬菌種，并且一些菌株在體外表現(xiàn)出與促進(jìn)植物生長有關(guān)的特性，包括IAA的產(chǎn)生［7]、鐵孢子的產(chǎn)生［8]和體外對(duì)疫霉菌［9]的拮抗作用。但目前對(duì)馬西利亞菌在植物促生效果方面的研究還相對(duì)較少。本研究分離純化得到的一株馬西利亞屬的菌株 B260，具有多種植物促生性狀，且固氮、解磷能力較強(qiáng)，可促進(jìn)番茄、黃瓜、甘草和黃芪幼苗生長，旨為該菌用于育苗提供理論依據(jù)和奠定實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土的采集、供試菌種及種子 參考席嬌［10]取樣方法，采集巴拉貢地區(qū)沙冬青的根際土。菌株 B260 是分離自巴拉貢沙冬青根際的一株植物促生菌。

本研究所用番茄種子為西安市群星種業(yè)有限責(zé)任公司的上海908，黃瓜種子為山東省德州魯?shù)路N業(yè)有限公司的津春四號(hào)以及購置于民勤縣花果山農(nóng)林工程有限公司的黃芪和甘草。

1.1.2 主要試劑和儀器及培養(yǎng)基 DL2000 DNA Marker、SYBR GreenⅠ熒光染料（北京全式金生物技術(shù)有限公司），常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），全自動(dòng)高溫高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogyo Co. Ltd.），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），MGC-350BP-2型光照培養(yǎng)箱（上海今有實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），GQ-75RZ 型高速管式離心機(jī)（遼陽鑫陽光液體分離設(shè)備有限公司），Synergy-H4型酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷（植酸磷）培養(yǎng)基及Ashby 培養(yǎng)基［11]，DF 培養(yǎng)基及 ADF 培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基［12]。

改良 PVK 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，磷酸鈣 5.0，硫酸銨0.5，氯化鈉0.2，七水合硫酸鎂0.1，氯化鉀0.2，酵母粉0.5，一水合硫酸錳0.002，七水合硫酸亞鐵 0.002，0.4% 溴酚藍(lán)（pH 6.7）6.0，pH 7.0-7.2。

1.1.3 育苗基質(zhì) 育苗基質(zhì)的基本組分含秸稈、黏土、磷鉀礦粉、營養(yǎng)土，其重量比為30∶12∶1∶15，其中磷鉀礦粉為磷礦粉和鉀礦粉等重量比混合物。

1.2 方法

1.2.1 根際促生細(xì)菌的分離純化及培養(yǎng) 稱取1 g根際土壤放入裝有99 mL無菌水的三角瓶中，28℃，180 r/min，振蕩30 min，靜置15 min。吸取上述懸液1 mL，用無菌水稀釋，制備10-1-10-5五個(gè)梯度稀釋液，將稀釋液接種涂布于固氮和無機(jī)磷固體培養(yǎng)基，劃線至無雜菌，選擇能力較強(qiáng)的B260用于后續(xù)研究。B260液體培養(yǎng)用1/2 R2A，于溫度 37℃和轉(zhuǎn)速 150 r/min 下振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2.2 1 6S rRNA基因擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化分析 將菌株活化后提取細(xì)菌總DNA為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，擴(kuò)增體系和條件參考楊鴻儒［13]擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化及測序。在 Ez-Taxon（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）數(shù)據(jù)庫中與模式菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，確定其種屬；之后基于 Neighbor-Joining 法，利用MEGA 7.0 軟件中相關(guān)模塊、以默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。B260 的 16S rRNA 基因登錄號(hào)為 MN173846。

1.2.3 PGPR菌株的基本促生能力分析 參考楊鴻儒等［13]對(duì)菌株固氮能力、解植酸磷（有機(jī)磷）能力、解無機(jī)磷能力及產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行分析；參考Glickmann 等［14]對(duì)菌株產(chǎn) IAA 能力進(jìn)行分析；參考Penrose 等［15]對(duì)菌株 ACC 脫氨酶活性進(jìn)行分析。

1.2.4 育苗及實(shí)驗(yàn)設(shè)置 將已滅菌的育苗基質(zhì)裝至距離市售聚苯乙烯育苗盤（規(guī)格：穴數(shù)50，高 4.5 cm，上邊長18 cm，下邊長 8 cm）穴檐1 cm處；挑選完整飽滿種子進(jìn)行春化誘導(dǎo)后播種，之后覆蓋基質(zhì)約1 cm；設(shè)2個(gè)處理，即添加菌株B260的pB260以及不添加菌的CK，每組處理5個(gè)生物學(xué)重復(fù)；以10 000×g離心力離心 B260 培養(yǎng)液，對(duì)離心所得沉淀物以蒸餾水重懸、再離心進(jìn)行洗滌，反復(fù)3次，最后再以蒸餾水重懸，菌液濃度106CFU/mL；pB260處理中的育苗穴在播種后每穴澆30 mL重懸菌液，對(duì)照CK澆等體積的蒸餾水；將育苗盤置于光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)至30 d，期間適當(dāng)澆灌蒸餾水，使基質(zhì)處于濕潤狀態(tài)。

1.2.5 幼苗生長性狀測定

1.2.5.1 發(fā)芽率、株高、根長的測定 植物在育苗盤出苗生長至 30 d，記錄發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率。將植株挖出，并將所有幼苗洗凈擦干后，平鋪于水平臺(tái)上，用刻度尺量出幼苗的長度，再用鑷子將植株根系拉直，測定主根長度，并做記錄。

1.2.5.2 生物量的測定 將植株表面泥土去除、洗凈、用濾紙將水吸干，測其鮮重生物量；再用信封將其包裝，置于烘箱，在80℃下烘48 h至恒重，用電子天平測其干重生物量，并做記錄。

1.2.5.3 葉綠素含量的測定 選取植物頂葉至倒四葉，去除葉脈，混勻后剪碎，稱取 0.2 g 放入 25 mL 具塞比色管中，25℃避光培養(yǎng)，且多次搖動(dòng)，待葉片全部變白即可測定，以提取液為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測定 OD663和 OD645，重復(fù)3次。計(jì)算公式為：葉綠素含量（mg/g）=（20.29×OD645+8.05×OD663）×5/40。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用 Microsoft Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，采用單因素方差分析［16]（One-Way ANOVA）和新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

測序所得 B260 的 16S rRNA 的基因序列長度為 1 222 bp，經(jīng) Ez-Taxon 分析表明，該序列與現(xiàn)有模式菌株Massilia plicata76T的相似性最高，為99.85%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1）也表明，B260與M. plicata76T菌株親緣關(guān)系最近，且其在進(jìn)化樹上與Massilia屬模式種處于同一進(jìn)化支，說明該菌株屬于Massilia屬。

2.2 植物促生性狀和能力分析

菌株 B260 的適宜生長溫度為 32℃、適宜生長pH 6.0，適宜生長鹽度為 3%。其還具有固氮、解磷（無機(jī)磷-解磷酸鈣和有機(jī)磷-植酸磷）、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC脫氨酶和產(chǎn)鐵載體的植物促生性狀，且固氮和解解無機(jī)磷能力較強(qiáng)，而其它能力相對(duì)較弱（表1）。

表1 植物促生性狀和能力

2.3 幼苗生長性狀分析

2.3.1 幼苗的生長形態(tài) 直接觀察從育苗盤穴挖出的幼苗形態(tài)發(fā)現(xiàn)，添加菌株B260的處理pB260相比不添加的處理CK的幼苗更大、更壯，特別是明顯促進(jìn)了番茄和黃瓜幼苗根系的發(fā)育。而更發(fā)達(dá)的根系將育苗基質(zhì)纏繞得更加緊實(shí)、這有利于移苗過程中苗塊形態(tài)和水分的保持，生長促進(jìn)效果最為突出（圖2和圖3）。

圖2 B260處理下黃瓜的育苗形態(tài)

2.3.2 幼苗的生長性狀 育苗30 d 后，pB260 較 CK處理下的番茄、黃瓜、甘草及黃芪的生長性狀均有不同程度的提高。其中，發(fā)芽率提高最大的為黃芪（37.08%）、其次為甘草（27.27%）；株高提高最大為黃瓜（34.39%）、其次為甘草（17.04%）；根長增長最大的為黃瓜（90.47%）；葉綠素含量提高最大為甘草（22.73%）、其次為黃芪（14.29%）；整株干重提高最大為甘草（133.33%）、其次為番茄（75.00%）；整株鮮重提高最大也為甘草（35.71%）、其次為番茄（18.75%）（表 2）。

而且 B260 對(duì)番茄和黃瓜的根系形態(tài)影響顯著，圖3-A、3-B 可見接種菌株的番茄和黃瓜根系發(fā)達(dá)，主根更長，而對(duì)照主根較短，表明這株菌對(duì)番茄和黃瓜根系的生長發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用，可以作為番茄和黃瓜專用微生物肥料的首選菌種。

圖3 四種植物幼苗生長性狀

3 討論

培育健壯幼苗對(duì)實(shí)現(xiàn)作物早熟增產(chǎn)有重要作用［17]。近年來，育苗逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種使植物快速、穩(wěn)定生長發(fā)育的技術(shù)。育苗基質(zhì)支持著穴盤苗從種子萌發(fā)到幼苗移栽的生長過程，基質(zhì)的優(yōu)劣是育苗成敗的基礎(chǔ)和關(guān)鍵［18]。目前的育苗中，大多是使用草炭作為基質(zhì)的主要成分，其育苗效果較好，但其來源匱乏且不可再生。因此，選取更好的、取材更易的基質(zhì)來減少草炭使用成為未來育苗的必經(jīng)之路。任志雨等［19]研究說明，在育苗基質(zhì)中加入蛭石或草炭可明顯改善基質(zhì)的理化性狀。50%秸稈加50%蛭石或草炭處理的黃瓜幼苗的株高、鮮重和葉綠素含量均大于其它處理。而本研究中則以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈作為主要成份，以少量營養(yǎng)土和磷鉀礦粉復(fù)配，有較好保水效果、成本低和容易操作等優(yōu)點(diǎn)［20]。少量研究表明，基質(zhì)中添加PGPR可促進(jìn)育苗。PGPR 是一種有益的、自由生活的土生細(xì)菌［21-22]，PGPR 通過生物固氮、植物激素的合成、養(yǎng)分的吸收以及提升寄主植物對(duì)生物、非生物脅迫的抗性來促進(jìn)植物生長［23-24]。在育苗過程中加入植物促生微生物，可明顯增加幼苗的成活率，降低土傳病的危害。浩折霞［25]研究發(fā)現(xiàn)，將具有多種植物促生性狀的優(yōu)化功能菌組合 HR69+QL-A6 接入基質(zhì)中，明顯提高了番茄幼苗出苗率、植株地上部與地下部干重、根系活力，分別增加 9%、47.9%、27.3%、28.7%，莖粗增加 28%，使番茄幼苗具有更強(qiáng)的抗倒伏性和環(huán)境適應(yīng)性。朱忠彬等［26]研究發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3 能顯著促進(jìn)煙草的生長。岳東霞［27]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌CBT1、CBT6 及 CBT7 對(duì)黃瓜枯萎病具有一定的防治效果。王娟等［28]表明，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）HG28-5 浸種處理能顯著提高黃瓜的出苗勢，提高出苗整齊度；顯著增加苗期黃瓜株高、根長、鮮重。梁建根等［29]研究表明，CH1 短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）與 CH2 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）都顯著地提高了葉綠素的含量，從而間接地促進(jìn)了黃瓜的生長。但是對(duì)于Massilia在植物促生方面的研究鮮見報(bào)道。本研究中菌株 B260屬于馬西利亞菌，其具有多種植物促生性狀，其具有的較強(qiáng)固氮和解磷能力可能為植物生長提供較充足的氮和磷營養(yǎng)供應(yīng)。根長和根系干重的增加還可能與菌株合成 IAA 能力有關(guān)，有利于增加根表面積，有效促進(jìn)根系的新陳代謝［30]。B260 具有的產(chǎn) IAA等激素等性狀，也明顯促進(jìn)了所研究植物根形態(tài)的建成。特別是甘草和黃芪作為藥材，藥用部分最主要為根。因此，根系的生長發(fā)育對(duì)育苗甚為重要［31-32]，較好的根系形態(tài)有助于移苗成活和后期的生長發(fā)育。而存留于育苗基質(zhì)“微環(huán)境”中的所添加的 PGPR在移苗后還可能繼續(xù)發(fā)揮植物促生功能和作用?？傊?，在育苗基質(zhì)中添加諸如馬西利亞菌或芽孢桿菌等 PGPR 從而促進(jìn)育苗是可行的。

表2 菌株B260對(duì)4種植物的苗期生長性狀

4 結(jié)論

Massiliasp. B260 具有多種植物促生能力，在育苗方面表現(xiàn)出良好的促生效果，這為未來開發(fā)、研究作為育苗基質(zhì)用菌種提供了理論依據(jù)，并奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。