蔡娟 劉流 王靈軍 曹建平 鄭明輝， 劉暉

（1. 遵義醫(yī)科大學(xué)，遵義 563003；2. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，上海 200025）

岡田繞眼果蠅（Amiota okadai），屬于雙翅目蠅科（Diptera），雖然在我國(guó)呈分散分布，但卻與人類生活密切相關(guān)。不僅由于它們攜帶成百上千種病菌，能夠傳播多種疾病，更因其作為結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)的中間宿主［1]，與近年來(lái)結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)病例的局部流行密切相關(guān)［2]。蠅類通常在腐敗、骯臟的惡劣環(huán)境下生活，但種群卻十分強(qiáng)大，重要原因就是由于其具有強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)，可以有效地抵御異源侵?jǐn)_［3-4]。昆蟲(chóng)具有識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲(chóng)等病原體的有效機(jī)制，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引發(fā)一系列的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，其中體液免疫中關(guān)鍵的抗菌因子-抗菌肽，在先天免疫中占據(jù)十分重要的地位［5-6]。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs），是一類低分子量的短肽，大多數(shù)是由陽(yáng)離子和疏水性殘基組成的兩親分子［7-8]。由于其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、絲狀真菌、原生生物以及包膜病毒在內(nèi)的微生物都具有快速且有效的殺傷效果，因此被稱為“自然抗生素”［9]，因其多通過(guò)靜電和疏水作用吸附于細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮活性，而這種獨(dú)特的作用機(jī)制使細(xì)菌很難通過(guò)改變細(xì)胞膜成分對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥性［10]，因此抗菌肽大有成為傳統(tǒng)抗生素理想替代品的趨勢(shì)。此外，由于近年來(lái)抗生素的濫用，耐藥細(xì)菌已成為嚴(yán)重危害人類健康的問(wèn)題，因此鑒定和開(kāi)發(fā)新的抗菌劑也亟待解決［11]。但由于天然抗菌肽在生物體內(nèi)含量較低，直接提取步驟繁瑣且效率低、成本高，提取物的純度也難以保證，因此規(guī)模化生產(chǎn)短期還難以實(shí)現(xiàn)［12]。目前的研究表明基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理論和實(shí)踐上都已成為可行。因而通過(guò)基因克隆、表達(dá)的方式獲取目的抗菌肽，越來(lái)越受到人們的重視［13]。目前用于表達(dá)抗菌肽的基因工程表達(dá)系統(tǒng)有原核和真核兩種，其中真核表達(dá)系統(tǒng)除了具有蛋白表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，還能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后的加工，從而保證了表達(dá)產(chǎn)物活性高［12]。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽是當(dāng)前抗菌肽基因工程表達(dá)研究中應(yīng)用較廣泛的方法［14]。

目前已鑒定的蠅類中的抗菌肽有 attacin、cecropin［15]、diptericin［16]、defensin［17]、MDAP-2D［18]及 Muscin 等。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定了轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中多個(gè)和前述抗菌肽同源的unigene，隨后通過(guò)差異表達(dá)譜分析篩選出一個(gè)表達(dá)量高且有顯著差異的基因unigene6686_AO-1，將其命名為aoattacin（未發(fā)表數(shù)據(jù)），通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列具備分子量小、富含脯氨酸、疏水性氨基酸等較多抗菌肽的特征，本研究利用昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)，并對(duì)其生物活性進(jìn)行鑒定，為相關(guān)抗生素替代品的研發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

岡田繞眼果蠅：由本實(shí)驗(yàn)室保種和飼養(yǎng)，幼蟲(chóng)使用發(fā)酵1-2 d的蘋(píng)果、香蕉、梨果塊進(jìn)行飼養(yǎng)，每2 d換一次水果。飼養(yǎng)溫度25-30℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照8 h/d［1]。抑菌實(shí)驗(yàn)菌種：抑菌實(shí)驗(yàn)所用菌種由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心曹建平研究員和遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院宋鴻教授饋贈(zèng)。革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；革蘭氏陰性菌：傷寒桿菌（Salmonella typhi）、銅假綠單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痢疾菌屬（Shigellasp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、變形菌（Proteus species）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；aoattacin基因、Sf9細(xì)胞、質(zhì)粒pFastbac1、E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、AB-PCR儀（北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司）；Tanon-1600凝膠成像儀（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）；DYY-8C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-ID超凈工作臺(tái)（蘇州江東精密儀器有限公司）；HH-3D恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；GHP-9160培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Thermo離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；BIC-400人工氣候箱（上海博迅公司）；HR40-II A2生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 岡田繞眼果蠅總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 果蠅培養(yǎng)在遵義醫(yī)科大學(xué)-貴州省普通高等學(xué)校傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）的人工氣候箱中進(jìn)行［1]，選擇3齡果蠅幼蟲(chóng)采用RNA提取試劑盒（北京莊盟）提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，利用核酸定量?jī)x測(cè)定其濃度和純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京莊盟）合成 cDNA。

1.2.2 抗菌肽aoattacin基因的篩選、分析、驗(yàn)證及合成 利用轉(zhuǎn)錄組中unigene的注釋文庫(kù)結(jié)合已知的抗菌肽基因序列做序列查詢，利用BLASTp從轉(zhuǎn)錄組里篩選到5個(gè)抗菌肽aoattacin同源基因。為了進(jìn)一步確定篩選的序列為抗菌肽序列，使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析基因的同源性。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量及表達(dá)譜分析，篩選到一個(gè)高表達(dá)的aoattacin基因，通過(guò)PCR進(jìn)行驗(yàn)證。隨后對(duì)候選的aoattacin基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，送成都擎科生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成，合成時(shí)分別在5'端添加BamH I酶切位點(diǎn)和信號(hào)肽序列，3'端添加EcoRI 酶切位點(diǎn)和6個(gè)His標(biāo)簽，引物為aoatt-F：5'-TTCATACCGTCCCACCATCGGGCGC GGATCCATGGAGTCCCACATGCTGCTGTTCCTGTT-3'：aoatt-R：5'-GCTCGTCGACGTAGGCCTTTGAATTCT CAGTGATGGTGGTGGTGGTGGCAGATCCAGGAA-3'。合成序列的測(cè)序驗(yàn)證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin的構(gòu)建及鑒定BamHI和EcoRI雙酶切aoattacin基因與pFastbac1載體后，進(jìn)行連接（基因2 μL、載體100-200 ng、ligase buffer 2 μL、T4 ligase 2 μL、20 μL 總 體積，16℃過(guò)夜），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。PCR驗(yàn)證單克隆菌落，引物序列為：pbattF：5'-AAATGATAACCATCTCGC-3'；pbattR：5'-TTCAGGTTCAGGGGGAGGTG-3'。用SnaB I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.4 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定 將20 ng的pFast-bac1-aoattacin加入大腸桿菌 DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑及抗生素篩選實(shí)驗(yàn)。對(duì)得到的8個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證。引物為 M13-F：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'，M13-R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，測(cè)序驗(yàn)證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.5aoattacin基因在Sf9細(xì)胞中表達(dá)及驗(yàn)證 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及P1、P2代病毒擴(kuò)增：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力大于95%的Sf9細(xì)胞接種（9×105個(gè)細(xì)胞/2 mL/孔）于六孔板中，制備Bacmid與Cellfectin?II Reagent復(fù)合物，用SF 900Ⅱ（不含雙抗）培養(yǎng)基稀釋后，加到每個(gè)孔中，27℃孵育5 h，去掉復(fù)合物混合液，加入SF 900Ⅱ（含雙抗）培養(yǎng)基，27℃濕度孵育至細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染跡象，收獲P1代病毒（106pfu/mL，1 000 r/min，離心5 min，用0.2 μm的濾膜過(guò)濾上清）；繼續(xù)擴(kuò)增P1代病毒到P2代（1×107-1×108pfu/mL）。Aoattacin的表達(dá)、純化：接種活力大于95%的Sf9細(xì)胞2×106個(gè)至200 mL搖瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，加入P2代病毒（1∶100，培養(yǎng)72 h），離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)基上清提取細(xì)胞裂解物粗蛋白（參照昆蟲(chóng)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）。鎳柱親和層析純化后，對(duì)抗菌肽進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)、純化。MOI優(yōu)化：在分析Aoattacin表達(dá)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)不同的條件導(dǎo)致不同的表達(dá)水平。為了優(yōu)化Aoattacin的表達(dá)，對(duì)Sf9細(xì)胞（活力大于95%，2×106個(gè)）接種至30 mL搖瓶生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，分別按照1∶20、1∶100、1∶500的比例加入P2代病毒，感染48 h、72 h后離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)基上清，設(shè)定alpha-L-fucosidase作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量并純化。

1.2.6 Aoattacin的抑菌活性檢測(cè) 將抑菌實(shí)驗(yàn)菌株在LB培養(yǎng)基中（200 r/min，37℃）培養(yǎng)10 h，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)（OD600≈0.2），新鮮LB培養(yǎng)基稀釋菌液×100備用。將純化的Aoattacin蛋白用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，取90 μL細(xì)菌稀釋液和10 μL蛋白稀釋液加入96孔板中，23℃ 100 r/min培養(yǎng)12 h。分別以 10 μL 無(wú)菌水和 10 μL 氨芐青霉素（30 μg/mL）作為陰性和陽(yáng)性平行對(duì)照。在利用分光光度計(jì)OD600下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌液的濁度，來(lái)判斷其是否具有抑菌活性，并測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），把與陰性對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組達(dá)到85%以上細(xì)菌死亡的多肽濃度定義為最小抑菌濃度（MIC，每組3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)），實(shí)驗(yàn)及菌種保存均在衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）的生物安全柜中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽基因的篩選、分析及全基因合成

通過(guò)同源注釋及從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出來(lái)的aoattacin基因包含以下5個(gè)：CL948.Contig1_AO-1、CL948.Contig2_AO-1、Unigene30284_AO-1、Unigene6686_AO-1、Unigene9478_AO-1，為避免注釋的錯(cuò)誤，我們從BLASTp比對(duì)序列中，選取了2個(gè)高同源性、高置信的外源attacin基因作為參考序列（E value = 0）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果證明了BLAST比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果，岡田繞眼果蠅的5個(gè)抗菌肽基因聚在一個(gè)進(jìn)化樹(shù)分支，與2個(gè)外源參考序列明顯分開(kāi)（圖1）；PCR進(jìn)行驗(yàn)證候選unigene6686_AO-1（1 200 bp），長(zhǎng)度及測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致（圖2-A）；選擇其中最長(zhǎng)的ORF，經(jīng)密碼優(yōu)化后添加信號(hào)肽、His標(biāo)簽、BamH I和EcoR I 酶切位點(diǎn)后進(jìn)行全基因合成，合成后的產(chǎn)物通過(guò)電泳（圖2-B）及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，并且未發(fā)現(xiàn)堿基突變和缺失。

圖1 aoattacin基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin的構(gòu)建及鑒定

陽(yáng)性克隆的PCR結(jié)果（圖3-A）顯示目的條帶在約1 000 bp位置，符合預(yù)期，序列測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果也表明目的基因序列成功連接至載體上；將重組質(zhì)粒用SnaBI和Hind III雙酶切，電泳結(jié)果表明目的基因（約750-1 000 bp）和質(zhì)粒（約3 000-5 000 bp）條帶均符合預(yù)期（圖3-B），測(cè)序驗(yàn)證也顯示序列與預(yù)期序列一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin構(gòu)建成功。

圖2 候選aoattacin基因的PCR鑒定（A）、全基因合成aoattacin基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定（B）

圖3 菌落PCR結(jié)果（A）、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）

2.3 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定

對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落的質(zhì)粒進(jìn)行PCR并測(cè)序驗(yàn)證，電泳結(jié)果（圖4）顯示在3 000 bp處出現(xiàn)明顯條帶，符合預(yù)期（理論2 936 bp），測(cè)序結(jié)果也顯示與預(yù)期序列一致，說(shuō)明重組Bacmid構(gòu)建成功。挑選DNA濃度最高的菌落（8號(hào)）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 重組Bacmid PCR鑒定

2.4 Aoattacin蛋白的表達(dá)、純化與分析

利用SDS-PAGE對(duì)鎳柱親和層析純化前后的培養(yǎng)上清及細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)：在培養(yǎng)基及細(xì)胞破碎后的上清中無(wú)明顯目的蛋白條帶（圖5-A）；Western Blot顯示該蛋白在細(xì)胞破碎離心后沉淀樣中存在（圖5-B），上述結(jié)果表明Aoattacin蛋白為跨膜蛋白但表達(dá)量不高。分析了Aoattacin的表達(dá)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)不同的條件導(dǎo)致不同的表達(dá)水平，進(jìn)一步通過(guò)MOI優(yōu)化表達(dá)條件，但產(chǎn)量沒(méi)有明顯提高（圖6）。

圖5 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）檢測(cè)200 mL細(xì)胞表達(dá)純化

2.5 抑菌活性檢測(cè)

純化的岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin對(duì)各種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)表明Aoattacin對(duì)金黃色葡萄球菌在內(nèi)的20種受試細(xì)菌都具有抑菌作用，其中對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，MIC值為0.68 μmol/L，對(duì)革蘭氏陰性菌黏質(zhì)沙雷氏菌的抑制作用最弱，其MIC值為11.25 μmol/L。結(jié)果顯示岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果要更好。

圖6 MOI優(yōu)化表達(dá)及檢測(cè)

3 討論

岡田繞眼果蠅作為一種重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)，是結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)主要傳播媒介。雖然其分布有著局部分散的特點(diǎn)，但由于結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)病例的日趨增多，其越來(lái)越多引起我們的研究。由于其飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖能力強(qiáng)，還有通過(guò)我們前期組學(xué)分析從其中鑒定了多種抗菌肽序列，因此它有望繼家蠅之后成研究抗菌肽的蠅類資源之一?？咕淖鳛橐活悘V泛存在于自然界生物體中的小分子多肽類物質(zhì)，是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分［19-20]。由于多重耐藥病原體的出現(xiàn)和傳播，昆蟲(chóng)抗菌肽成了替代抗生素的潛在生物資源庫(kù)，以解決當(dāng)前抗生素的局限性［21]。雖然可以通過(guò)化學(xué)合成方法獲得抗菌肽，但由于化學(xué)合成結(jié)構(gòu)的差異，往往需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾后才具有活性。如化學(xué)合成的線性抗菌肽1-Muscin無(wú)抑菌活性，而經(jīng)過(guò)環(huán)化修飾后的c-Muscin才對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用［22]。而利用原核表達(dá)系統(tǒng)，由于其細(xì)胞缺少蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾過(guò)程，表達(dá)真核來(lái)源的蛋白可能會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，另外，由于抗菌肽強(qiáng)烈的抑菌活性，有時(shí)也會(huì)在其表達(dá)過(guò)程中將宿主殺死，使得重組表達(dá)難以在原核微生物中進(jìn)行。真核表達(dá)系統(tǒng)則具有蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾過(guò)程，表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物化學(xué)功能等方面與天然蛋白分子相近，被廣泛使用。昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)使用的昆蟲(chóng)細(xì)胞可在無(wú)二氧化碳條件27℃進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，工業(yè)化生產(chǎn)方面具有天然優(yōu)勢(shì)，且昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)及操作較簡(jiǎn)便，成本低，因此被廣泛用于生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品。目前，全世界的學(xué)者已從100多種昆蟲(chóng)中建立了500多株細(xì)胞系。在國(guó)內(nèi)也有20多個(gè)昆蟲(chóng)細(xì)胞系建立。由于Spodoptera frugiperda細(xì)胞株Sf9 和 Sf21 以及Trichoplusia ni細(xì)胞株 High Five 和Tn-368 對(duì)AcMNPV 非常敏感，因而它們是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中常用的昆蟲(chóng)細(xì)胞［23]。此外，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)（APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php） 中 已經(jīng)收集了大約2 600種抗菌肽。然而昆蟲(chóng)的AMPS種類不到10%，因此對(duì)昆蟲(chóng)AMPS的研究對(duì)AMPS的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用具有重要意義［24]。隨著抗菌肽的深入研究和基因工程的廣泛應(yīng)用，昆蟲(chóng)抗菌肽的功能、工作機(jī)制將更加明確，其應(yīng)用也將更加多樣、廣泛。

表1 岡田繞眼果蠅Aoattacin對(duì)于細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）

本課題組前期利用化學(xué)合成方法獲得的抗菌肽Aoattacin蛋白對(duì)表1中的待選細(xì)菌，如：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）等的最低抑菌濃度均大于100 μmol/L（未發(fā)表數(shù)據(jù)），可以認(rèn)為對(duì)這些細(xì)菌沒(méi)有起到抑制作用。而本研究中通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)Aoattacin對(duì)上述細(xì)菌都具有很強(qiáng)的抑制效果，這表明與合成抗菌肽相比，真核細(xì)胞表達(dá)的Aoattacin抑菌譜更廣。此外，通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)家蠅Aoattacin的研究目前報(bào)道也較少，較為成功的有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中穩(wěn)定表達(dá)家蠅抗菌肽Attacin的報(bào)道［25]，而本實(shí)驗(yàn)成功將包含岡田繞眼果蠅抗菌肽aoattacin基因的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞，通過(guò)Western Blot對(duì)目的蛋白表達(dá)情況檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)目的條帶的位置與預(yù)測(cè)分子量（34 kD）有所偏差，我們推測(cè)由于真核表達(dá)蛋白存在一定后期修飾造成的分子量變化，后續(xù)我們也正在利用質(zhì)譜法對(duì)該蛋白進(jìn)行鑒定以證實(shí)其修飾方式。表達(dá)的Aoattacin蛋白的分子量與預(yù)測(cè)的大小基本一致，表明 Bacmid 重組質(zhì)粒在昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)。雖然經(jīng)過(guò)前期密碼子及MOI的優(yōu)化，但結(jié)果仍然顯示aoattacin基因在Sf9細(xì)胞中表達(dá)量較小，距離后期進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)仍有一定難度，但本實(shí)驗(yàn)也為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin成熟肽在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中的表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行蛋白檢測(cè)，Tricine-SDS-PAGE 及Western Blot分析結(jié)果表明aoattacin基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)，抑菌實(shí)驗(yàn)顯示Aoattacin對(duì)受試革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，是一種新型廣譜抗菌肽。