胡楚霄 雷善鈺 秦艷平 趙奕錦 向泉桔

（四川農(nóng)業(yè)大學資源學院微生物系，成都 611130）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類稠環(huán)化合物，主要來源是化石燃料的不完全燃燒，具有較強的致癌、致畸和致突變能力，對于生物毒害較大［1]。由于難以被生物降解，是美國環(huán)境保護署“優(yōu)先控制”的持久性有機污染物［2]。我國土壤PAHs污染情況較為嚴重。Liu等［3]研究顯示北京市周邊土壤中，總PAHs含量可能達到887 μg/kg；Zheng等［4]研究顯示，以成都為代表的西部地區(qū)土壤中PAHs最高含量約75 431 ng/g，平均值為3 106 ng/g。因此PAHs污染治理受到人們的日益關(guān)注。蒽是多環(huán)芳烴中一類重要的污染物質(zhì)，三環(huán)線性分子，水溶性極低，微生物降解難度大。

漆酶（EC 1.10.3.2）最早由日本Yoshida于1883年在東南亞的漆樹中發(fā)現(xiàn)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于植物、高等真菌以及少數(shù)細菌和昆蟲中［5]。1996年，Collins等［6]首次報道了漆酶對PAHs的降解作用。漆酶對于PAHs的降解具有高效性。Janikowski等［7]的研究顯示鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）分泌的漆酶對萘、菲和蒽的最高降解效率可達 98 mg/（L·h）；Majcherczyk 等［8]的研究顯示，在介體HBT的作用下，云芝菌所產(chǎn)漆酶對于常見14種PAHs降解效率高，可降解50%芘、苯并芘［a]和蒽，完全降解苊、苊烯、芴等。在真菌之中，以靈芝為代表的白腐真菌屬受到格外關(guān)注，其胞外漆酶活性高，易于純化［9]，且廣泛降解木質(zhì)素［10]。由于漆酶具有穩(wěn)定，無副產(chǎn)物等優(yōu)點，在造紙、環(huán)境保護、生物合成、食品加工和能源開發(fā)等行業(yè)中被大規(guī)模應(yīng)用［11-12]。

靈芝是一種名貴的藥食兩用真菌，屬于擔子菌亞門，最早記錄于《本草綱目》中。其富含甾醇、萜類等生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種功效［13]，在中國傳統(tǒng)中醫(yī)中具有重要作用，且近年來其商業(yè)價值被大規(guī)模開發(fā)，日益受到重視［14]。常用的抗氧化劑對人體有潛在的危害，故開發(fā)新型無害抗氧化劑有重要的意義。靈芝是受到長期關(guān)注的潛在資源。孟歌等［15]的研究結(jié)果表明靈芝具有較強的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化劑進一步開發(fā)利用。靈芝是真菌中主要產(chǎn)漆酶的種屬，不同靈芝產(chǎn)菌株產(chǎn)漆酶能力有較大的差異［16]。劉禹等［17]的研究結(jié)果顯示，有柄樹舌靈芝漆酶活性（均值1195.4 U/g）顯著高于其他菌種，靈芝S3、26A和甜靈芝的最大漆酶活性僅有其37%、27%和10%左右。而王書超等［18]對樹舌靈芝的進一步研究顯示，其產(chǎn)漆酶能力與碳源、氮源、溫度和pH等條件相關(guān)，且影響程度依次減小，表明不同的環(huán)境因素對微生物產(chǎn)漆酶能力影響較大。

活性與耐受力不足是現(xiàn)階段限制漆酶大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素，因此提高胞外漆酶活性具有重要意義［19]。此前已有大量研究證實化合物種類及濃度［20-22]、復合培養(yǎng)基及誘導物粒子大小對于產(chǎn)漆酶能力及胞外漆酶活性的影響［23-24]。但蒽作為一種外源物質(zhì)，對靈芝漆酶是否存在影響目前還鮮有研究。本研究以3株不同的靈芝菌株為實驗材料，分析在蒽的作用下，漆酶活性和漆酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平的響應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 3株靈芝菌株榮保1號、川芝和美芝，由四川農(nóng)業(yè)大學微生物系提供。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；丙酮（成都市科隆化學品有限公司）；蔥（純度99%，羅恩化學試劑公司）；2，2'-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）［2，2'-azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid），ABTS]（solarbio公 司 ）；M-MuLv第 一 鏈cDNA合成試劑盒（生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green Master Mix（Vazyme公司）。

1.1.3 主要儀器 iQ5熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；V-1100D型分光光度計（美譜達）。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 菌株保存與活化使用PDA固體培養(yǎng)基，菌株培養(yǎng)使用PDB培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，pH自然，定容至1 000 mL）。250 mL錐形瓶中加入50 mL PDB培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min。每個錐形瓶接種3塊活化的菌絲體（直徑1 cm），30℃避光恒溫靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后加入蔥（由丙酮配制成2.0 g/L母液，0.22 μm濾膜過濾除菌），使其終濃度為1.0 mg/L。同時設(shè)置兩組對照，一組加入等量丙酮，另外一組為空白對照。30℃避光恒溫靜置培養(yǎng)，分別于1 h、3 h、6 h、9 h和24 h取樣，用于酶活和轉(zhuǎn)錄表達水平分析。每個處理3個重復。

1.2.2 漆酶酶活性的測定 取1.0 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液，測定方法參照秦澎等［25]。測定反應(yīng)體系為2.7 mL 0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）、0.2 mL 0.5 mol/L ABTS和0.1 mL粗酶液。于波長420 nm處、30℃測定吸光度變化，計算漆酶活性。定義1 min氧化l μmol ABTS所需的酶量為一個酶活力單位（U/mL）。每個菌株3個重復，以煮沸滅活粗酶液為對照。

1.2.3 總RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR 取少量液氮保存的菌絲體，研磨成粉末狀，利用TRIzol法提取總RNA［26]，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。檢測合格的RNA使用M-MuLv第一鏈cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA。

以合成的cDNA為模板，對相關(guān)靈芝漆酶基因進行轉(zhuǎn)錄表達水平分析。qRT-PCR在iQ5（Bio-Rad）儀器上進行。熒光定量PCR反應(yīng)體系共計10.0 μL：Green Master Mix 5.0 μL，Rox Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL，引物0.4 μL，加入ddH2O補足至10.0 μL。qRT-PCR分析具體程序依據(jù)Mix說明書進行：95℃ 5 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；重復40個循環(huán)，60℃退火。以靈芝RPL4基因為內(nèi)參基因，所用引物序列參照文獻［27]，通過熔解曲線判定引物的特異性，利用雙δ法計算基因的相對轉(zhuǎn)錄表達水平。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel進行數(shù)據(jù)整理計算制表，利用SPSS進行相關(guān)性分析，利用Origin作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同處理條件下靈芝漆酶活性

不同處理時間及條件下，3株靈芝菌株漆酶活性存在差異，總的趨勢為抑制，促進多發(fā)生在處理時間較長的條件下（圖1）。美芝在蒽（En+BT）短時間處理下，漆酶活性小幅下調(diào)，但隨處理時間延長，漆酶活性不斷上升，當處理24 h時，漆酶活性達到22.93 U/mL，是對照（CK）和丙酮（BT）處理的1.29倍和1.43倍。榮保1號在3種處理條件下，漆酶活性均隨處理時間延長而上升。蒽（En+BT）處理3 h，漆酶活顯著上升，達到8.22 U/mL，是對照（CK）和丙酮（BT）的1.71和1.75倍；處理24 h時，丙酮（BT）和蒽（En+BT）處理下，漆酶活性達到最高，分別是對照（CK）的1.47和1.29倍。川芝在丙酮（BT）和蒽（En+BT）處理下，漆酶活性大幅降低至對照的一半左右。處理1 h后，分別為18.29 U/mL和17.31 U/mL，且隨著培養(yǎng)時間延長，漆酶活性無明顯變化。

圖1 美芝（A）、榮保1號（B）和川芝（C）

2.2 不同處理條件下靈芝漆酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平

利用qRT-PCR分析蒽處理下3株靈芝菌株漆酶基因在轉(zhuǎn)錄表達水平上的差異。同時分析丙酮作用下漆酶基因的轉(zhuǎn)錄表達規(guī)律。結(jié)果顯示（表1-3），除在川芝中，未檢測到2個漆酶基因（Glac6和Glac12）的轉(zhuǎn)錄本，其余漆酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平存在差異性和特異性。

美芝漆酶基因在蒽（En+BT）處理前期（1 h），所有漆酶基因均轉(zhuǎn)錄表達均被抑制，隨著培養(yǎng)時間的延長，部分漆酶基因的轉(zhuǎn)錄表達水平開始上升（表1）。3 h時，Glac15是對照的4.58倍；9 h時，Glac11是對照的8.80倍；在處理6 h后，Glac12轉(zhuǎn)錄表達水平一直上升，最高達到對照的33.92倍（24 h）。丙酮（BT）處理下，有5個漆酶基因（Glac1、3、5、12和15）的表達在不同處理發(fā)生了上調(diào)，其余10個漆酶基因的表達被不同程度地抑制。丙酮（BT）與蒽（En+BT）處理下漆酶的表達規(guī)律相比較，有4個漆酶基因（Glac6、9、11和14）在蒽（En+BT）處理下發(fā)生了上調(diào)。

表1 美芝漆酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平

榮保1號在蒽（En+BT）處理下，大多數(shù)漆酶基因（Glac1、Glac3-5、Glac7、Glac10-15）的轉(zhuǎn)錄表達高峰出現(xiàn)在處理9 h。Glac15、Glac12和Glac10在蒽（En+BT）處理下轉(zhuǎn)錄表達水平上調(diào)最大，分別為對照的34.9、26.12和18.58倍。其余基因轉(zhuǎn)錄表達峰值出現(xiàn)在處理6 h，上調(diào)幅度最大為Glac8，僅為對照的3.54倍。處理全過程中，Glac6和Glac9顯示被抑制，Glac6被抑制幅度最大，最低表達僅為對照的0.02倍。丙酮（BT）處理下，7個漆酶基因（Glac1、Glac7、Glac10-13和Glac15）轉(zhuǎn)錄表達峰值出現(xiàn)在9 h，Glac15和Glac10轉(zhuǎn)錄表達上調(diào)幅度最大，分別為對照的57.72和21.14倍。丙酮（BT）處理下，未見被明顯抑制的基因（表2）。整體而言，相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達水平均圍繞對照小幅波動，均有一個轉(zhuǎn)錄表達水平的峰值。Glac10受到促進效果最明顯，Glac15轉(zhuǎn)錄表達水平波動最大。

表2 榮保1號漆酶轉(zhuǎn)錄基因表達水平

川芝在蒽（En+BT）處理下，除Glac2和Glac3外，其余基因轉(zhuǎn)錄表達水平均快速下降至被抑制。處理1 h，轉(zhuǎn)錄表達水平上調(diào)幅度大于1 000倍的有Glac4（17799.83 倍）、Glac8（2820.46 倍）和Glac11（1371.05倍）。處理24 h，僅有Glac10轉(zhuǎn)錄表達水平表現(xiàn)為促進（14.79倍），Glac15轉(zhuǎn)錄表達水平已經(jīng)低于對照的0.01倍。Glac2和Glac3轉(zhuǎn)錄表達水平則隨處理時間延長而緩慢上升。處理24 h，Glac2轉(zhuǎn)錄表達水平已為對照的9.38倍。丙酮（BT）處理下，表達水平變化規(guī)律與蒽（En+BT）處理下基本一致（表3）?？傮w而言，兩種處理條件對于川芝漆酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平的影響一致，均為先促進后抑制。

表3 川芝漆酶轉(zhuǎn)錄基因表達水平

3 討論

已有研究報道發(fā)現(xiàn)，靈芝屬中不同菌株、冬菇不同菌株的產(chǎn)漆酶能力和規(guī)律存在較大的差異，與生長速度、培養(yǎng)條件等存在一定關(guān)聯(lián)［17，28]。本研究中，3株靈芝菌株的產(chǎn)漆酶能力存在差異，且在丙酮（BT）或蒽（En+BT）的脅迫下，漆酶活性的變化規(guī)律也存在差異，其中川芝漆酶活性一直被強烈抑制。3株菌株中，美芝在丙酮（BT）或蒽（En+BT）處理下，漆酶活性變化的幅度最小，暗示其耐受性較強，可作為蒽原位降解的候選微生物資源。

漆酶大多以同工酶的形式存在于生物體，如白腐真菌中含有11個漆酶同工酶基因［29]，靈芝中含有15個漆酶同工酶基因。在進化過程中，針對不同的環(huán)境脅迫，這些基因做出相應(yīng)的特征響應(yīng)。金屬Pb2+、Cd2+、Cu2+和Fe2+脅迫下，靈芝5個漆酶基因（Glac4、Glac6、Glac10、Glac11和Glac12）的轉(zhuǎn)錄表達水平發(fā)生上調(diào)［9]。丙酮或蒽作為一種外源物質(zhì)，對靈芝漆酶的轉(zhuǎn)錄表達水平存在不同的作用，且在不同的菌株中，漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄表達的響應(yīng)特征存在差異。菌株美芝相關(guān)基因表達差異較?。痪陿s保1號在丙酮（BT）處理下，漆酶基因Glac10的響應(yīng)較大，在蒽（En+BT）處理下，漆酶基因Glac10和Glac15的響應(yīng)較大；菌株川芝在丙酮（BT）處理下，漆酶基因Glac4和Glac10的響應(yīng)較大，在蒽（En+BT）處理下，漆酶基因Glac4、Glac9和Glac13的響應(yīng)較大。說明這些基因在靈芝菌株適應(yīng)丙酮（BT）和蒽（En+BT）的脅迫過程中可能發(fā)揮重要的作用。

通過分析丙酮（BT）或蒽（En+BT）處理下，3株菌漆酶活性與15個漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平變化的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，川芝中漆酶活性與較多的同工酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平顯著相關(guān)。兩種處理條件下，5個漆酶基因的轉(zhuǎn)錄表達水平與漆酶活性顯著相關(guān)，其中Glac2［BT：-0.93；（En+BT）：-0.75]和Glac3［BT：-0.87；（En+BT）：-0.76]表達水平與活性負相關(guān)，暗示這兩個漆酶在活性降低中可能起著主要作用。

4 結(jié)論

在1.0 mg/L蒽的處理下，3株靈芝菌株在漆酶活性和漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄表達水平上表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特征。川芝漆酶活性最高，在丙酮（BT）或蒽（En+BT）作用下，漆酶活性被抑制程度最強，相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達水平波動幅度也最大，表明川芝可能對丙酮（BT）或蒽（En+BT）脅迫較敏感。美芝漆酶活性和基因轉(zhuǎn)錄表達水平在丙酮（BT）或蒽（En+BT）存在情況下均受到抑制，但波動較小，暗示該菌株對這兩種物質(zhì)的耐受力較強，可作為原位降解蒽的一個微生物資源。榮保1號漆酶活性隨著丙酮（BT）或蒽（En+BT）脅迫時間的增加而不斷上升，但漆酶基因的轉(zhuǎn)錄表達水平未發(fā)生較大變化，顯示該菌株對丙酮或蒽（En+BT）有較強的適應(yīng)能力。