趙曉霞 牛世全 文娜 蘇鋒鋒

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

黃芪（Astragalus membranaceus），多年生草本植物，具有滋補(bǔ)等藥用功效。近年來，因栽培、連作面積增多，致使黃芪病害加重，其中根腐病是影響黃芪產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病害之一。黃芪根腐病發(fā)生在整個(gè)生育時(shí)期，發(fā)病過程是由根莖向下，由主根向側(cè)根蔓延，根表面出現(xiàn)病斑且表皮粗糙，對(duì)病株的根部進(jìn)行裝片制作觀察病根結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病株維管束組織變褐色，有明顯被溶解的現(xiàn)象。黃芪根腐病病原菌包括茄腐鐮刀菌（Fusarium solaniun）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等［1]。目前對(duì)黃芪根腐病的防治主要是化學(xué)農(nóng)藥防治，但隨著現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，生物防治體現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)。因此，探索有效的生物防治方法正逐漸引起人們的重視。本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中分離篩選出的21株芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，研究該類菌對(duì)黃芪根腐病病原菌的抑制作用，并篩選出對(duì)黃芪根腐病病原菌具有較好防治效果的拮抗芽孢桿菌菌株，以期為黃芪根腐病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯20 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.5-2.0 g，水100 mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5-2 g，水100 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，水100 mL，pH 7.0。

1.1.2 供試菌株 芽孢桿菌：敦煌地區(qū)鹽堿土壤中分離篩選得到21株芽孢桿菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。指示病原菌：分離自甘肅隴西黃芪1號(hào)栽培基地的黃芪根腐病病原菌G2茄腐鐮刀菌（F. solaniun），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 生防芽孢桿菌的初篩 將保存的21株芽孢桿菌接于NA平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h后備用，黃芪根腐病病原菌G2在PDA平板，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化6 d后備用。采用平板對(duì)峙法［2]測(cè)定21株芽孢桿菌對(duì)黃芪根腐病原菌G2抑菌率，各處理3次重復(fù)，在28℃恒溫培養(yǎng)5 d。計(jì)算公式：抑菌率 =（對(duì)照組直徑-試驗(yàn)組直徑）/對(duì)照菌落直徑 ×100%［2]。

1.2.2 生防芽孢桿菌的復(fù)篩 選擇初篩中抑菌率大于70%的菌株進(jìn)行復(fù)篩，將活化后待篩選的拮抗芽孢桿菌分別接入等量的NB液體培養(yǎng)基中，在37℃，160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)好的菌液在4℃，10 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，上清液用0.22 μm的微孔濾器過濾，得到無(wú)菌上清液，備用［3]。

采用瓊脂擴(kuò)散法，將PDA培養(yǎng)基在滅菌后冷卻至50℃左右，以200∶1的比例加入病原真菌菌懸液，混合均勻后倒入已用水瓊脂作為底層的培養(yǎng)皿中，制備帶菌平板，待平板凝固后，用已滅菌的打孔器在平板上打孔，向孔內(nèi)加入200 μL發(fā)酵上清液，以加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照組，各處理3次重復(fù)。在28℃恒溫培養(yǎng)3 d后，利用上述計(jì)算公式測(cè)定抑菌率，篩選出對(duì)黃芪根腐病病原菌G2拮抗作用最強(qiáng)的菌株。

1.2.3 菌體形態(tài)觀察 將優(yōu)勢(shì)生防芽孢桿菌接種于NA培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，再對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察優(yōu)勢(shì)生防芽孢桿菌的菌落、菌體形態(tài)特征。

1.2.4 生理生化特征測(cè)定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［4]與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［5]對(duì)篩選出來的優(yōu)勢(shì)生防芽孢桿菌株進(jìn)行明膠液化、淀粉水解等生理生化鑒定。

1.2.5 1 6S rDNA 基因序列分析 采用土壤DNA小量提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，采用16S rDNA細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：模板 DNA 4 μL，引物各 1 μL，Taq 酶15 μL，ddH2O 9 μL ；反應(yīng)參數(shù) ：95℃ 5 min；95℃1 min，57℃ 1 min，72℃ 2 min， 共 25個(gè) 循 環(huán) ；72℃總延伸10 min。PCR 擴(kuò)增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至甘肅中鼎森生物科技有限公司測(cè)序，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA7.0軟件，設(shè)置Bootstrap values為1 000，使用鄰近法方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［2]。

1.2.6 拮抗芽孢桿菌的盆栽防效試驗(yàn) 通過黃芪苗盆栽試驗(yàn)測(cè)定拮抗芽孢桿菌對(duì)該病原菌的防治作用。（1）病原菌孢子懸液的制備：分別刮取PDA平板上28℃，培養(yǎng)10 d的病原菌，將其分散到6 g/L CMC（羧甲基纖維素鈉）溶液中制成孢子懸液，孢子濃度調(diào)至 2.0×107CFU/mL［6]。（2）盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) ：從甘肅隴西黃芪1號(hào)栽培基地選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康蒙古黃芪苗分成3組，即空白組（不接菌種）、對(duì)照組（接種病原菌）、試驗(yàn)組（接種病原菌和拮抗芽孢桿菌），每處理12盆，每盆3株，幼苗移栽至裝有混合營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1）的塑料小花盆中，14 d后采取傷根灌注法［7]向?qū)φ战M和試驗(yàn)組接種上述病原菌孢子懸液，每盆接種量均為5 mL，以接等量無(wú)菌水為對(duì)照。接種病原菌14 d后，分別向每盆試驗(yàn)組接種5 mL拮抗芽孢桿菌發(fā)酵濾液，以接等量無(wú)菌水為空白對(duì)照。（3）防效測(cè)定：培養(yǎng)28 d后觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，按照植物病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算防治效果。黃芪根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，有病斑1%-5%；2級(jí)，有病斑6%-10%；3級(jí)，有病斑11%-20%；4級(jí)，有病斑21%-40%；5級(jí)，有病斑41%-60%；6級(jí)，病斑61%-80%；7級(jí)，81%以上。計(jì)算公式：發(fā)病率 = 發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=∑（病級(jí)總株數(shù)×發(fā)病級(jí)別）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別）×100%；防治效果 =（對(duì)照病情指數(shù)-試驗(yàn)病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù) ×100%［8]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，處理間差異的多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)勢(shì)生防芽孢桿菌篩選結(jié)果

通過對(duì)21株供試芽孢桿菌的初步篩選，獲得了10株對(duì)黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2抑菌效果較好的芽孢桿菌，其抑菌率大于90%（表1）；為了進(jìn)一步研究初篩菌株對(duì)該病原菌的拮抗能力與分泌產(chǎn)抗物質(zhì)能力的大小，通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株7-2-1-6的發(fā)酵上清液對(duì)茄腐鐮刀菌拮抗活性較高，抑菌圈直徑大且清晰，能很大程度的抑制茄腐鐮刀菌的生長(zhǎng)，其發(fā)酵上清液抑菌率達(dá)85.40%（圖 1）。

表1 拮抗芽孢桿菌對(duì)黃芪根腐病菌G2的抑制作用

2.2 菌株7-2-1-6的形態(tài)特征

菌株7-2-1-6在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面光滑，質(zhì)地黏稠。進(jìn)行革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），菌體短桿狀、呈紫紅色，因此，菌株7-2-1-6是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

圖1 菌株7-2-1-6的發(fā)酵液抑菌效果

圖2 菌株7-2-1-6菌落（A）菌體（B）形態(tài)

2.3 菌株7-2-1-6的生理生化特征

菌株7-2-1-6生理生化特征結(jié)果如表2所示。

表2 拮抗芽孢桿菌菌株7-2-1-2的生理生化特性

2.4 菌株7-2-1-6 16S rDNA基因序列分析結(jié)果

經(jīng)過對(duì)菌株7-2-1-6的16S rDNA 基因序列測(cè)定及分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株7-2-1-6與Bacillus subtilis（KX427024.1）屬同一個(gè)分支，結(jié)合形態(tài)特征與生理生化，可以鑒定菌株7-2-1-6為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。

圖3 菌株7-2-1-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株7-2-1-6對(duì)黃芪根腐病盆栽防效測(cè)定結(jié)果

通過對(duì)盆栽黃芪植株生長(zhǎng)發(fā)病情況的觀察記錄，在第28天的生長(zhǎng)發(fā)病情況如表3所示。

表3 菌株7-2-1-6對(duì)黃芪根腐病盆栽防治效果

通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定了菌株7-2-1-6對(duì)黃芪根腐病的防治效果。結(jié)果顯示對(duì)照組黃芪幼苗的株高和主根長(zhǎng)明顯小于空白組和試驗(yàn)組的株高和主根長(zhǎng)，對(duì)照組和試驗(yàn)組的顯著差異表明（圖4），菌株7-2-1-6能顯著降低黃芪根腐病的發(fā)病程度，防治效果達(dá)到68.80%（表3），說明菌株7-2-1-6對(duì)黃芪根腐病具有較好的防治作用。

圖4 黃芪根腐病拮抗菌盆栽防效試驗(yàn)

3 討論

芽孢桿菌是一類重要的具有生物研究?jī)r(jià)值的微生物資源，大部分生防芽孢桿菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖速度快、具有抗逆性，同時(shí)可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)［9]，在植物病害防治中有很高的應(yīng)用價(jià)值，陳倩倩等［10]發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）分泌的活性物質(zhì)能抑制尖孢鐮刀菌；陳志杰等［3]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌4-z-3發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)對(duì)多種植物病原真菌都有明顯的抑菌作用；李玉聰?shù)龋?1]研究發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用；雷白時(shí)等［12]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HD-5對(duì)草莓根腐病病原菌尖孢鐮刀菌有抑制作用，盆栽防治效果達(dá)77.78%。

本研究篩選鑒定出枯草芽孢桿菌7-2-1-6分離自敦煌地區(qū)鹽堿土壤中，是典型的極端環(huán)境，相比于自然條件下微生物而言，在鹽堿土壤等極端環(huán)境條件下生長(zhǎng)的微生物具有特殊的生理功能、遺傳特性及代謝方式等，因?yàn)樗鼈優(yōu)榱诉m應(yīng)惡劣極端的外界環(huán)境，經(jīng)過長(zhǎng)期的生長(zhǎng)和變化，產(chǎn)生了特殊的生理機(jī)能和代謝體系，所以極端環(huán)境中的微生物能夠?qū)a(chǎn)生大量的活性物質(zhì)，對(duì)于生物防治的應(yīng)用具有更大的潛能［13]。張飛鵬等［14]從大慶地區(qū)鹽堿土壤中分離出一株芽孢桿菌B. brevi優(yōu)勢(shì)種；董艷萍等［15]在塔克拉瑪干沙漠南麓及羅布泊地區(qū)分離出很多可能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)的放線菌；賈麗［16]從我國(guó)西部極端環(huán)境鹽湖區(qū)分離篩選出一定數(shù)量的耐高糖芽孢桿菌。

目前，對(duì)黃芪根腐病的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，而化學(xué)防治不僅會(huì)造成農(nóng)藥殘留污染環(huán)境，還會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，甚至?xí)档推焚|(zhì)［17]。鑒于此，通過拮抗微生物進(jìn)行生物防治已成為研究的熱門課題，高芬等［18]研究發(fā)現(xiàn)PGPR菌G10對(duì)黃芪根腐病病原菌有拮抗作用；牛世全等［19]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫鏈霉菌（Streptomyces tuirus）對(duì)黃芪根腐病的2種致病菌均有較好的抑制作用；鄭豆豆等［20]通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證的放線菌菌株DA4-3-12、DA8-4-10和221對(duì)黃芪根腐病的防效分別為60.1%、46%和69.99%。本研究以黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2為防治對(duì)象，通過平板對(duì)峙法和瓊脂擴(kuò)散法篩選得到一株生防芽孢桿菌7-2-1-6，該生防菌株發(fā)酵上清液對(duì)黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2的抑制率為85.40%，通過對(duì)該生防菌株的相關(guān)研究鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），同時(shí)，經(jīng)盆栽防效測(cè)定對(duì)黃芪根腐病防治效果約68.80%，具有良好的應(yīng)用前景，為黃芪根腐病的生物防治提供菌種資源。雖然菌株7-2-1-6盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的防治效果，但在實(shí)際生物防治過程中的施用濃度、方法、土壤類型及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等還需要進(jìn)一步驗(yàn)證與探究。

4 結(jié)論

以分離自敦煌地區(qū)鹽堿土壤中21株芽孢桿菌為研究對(duì)象，黃芪根腐病病原菌Fusarium solaniunKR997532為靶標(biāo)菌，篩選得到較強(qiáng)拮抗作用的生防芽孢桿菌7-2-1-6，將其鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），盆栽防效測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株7-2-1-6對(duì)黃芪根腐病具有良好的防治作用。