楊勝男 劉娜 宋東輝，2

（1. 天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457；2. 天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457）

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，重金屬鉻作為電鍍、制革、印染和制藥等行業(yè)的化工原料［1]會因泄漏和不合理排放而進入地下水，最終排入海洋，對環(huán)境造成嚴重污染。自然條件下鉻主要有Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）兩種存在形式［2]，其中Cr（Ⅵ）毒性約為Cr（Ⅲ）的100倍，具有很強的水溶性和遷移能力，并且致癌致畸變作用為Cr（Ⅲ）的1 000倍［3]，Cr（Ⅵ）污染的治理是我國環(huán)境保護領域關注的焦點問題。

目前的研究中，鉻污染治理的方法主要有吸附法、化學還原法、離子交換法和混凝法等。這些方法成本較高，容易造成二次污染，去除效果不好。而微生物修復技術因其成本低，效益高，無二次污染等特點，在處理鉻污染方面凸顯巨大的發(fā)展?jié)摿?。微藻可以吸附重金屬，同時利用環(huán)境微生物產(chǎn)生的CO2和等合成自身營養(yǎng)物質(zhì)生長，同時釋放O2；而細菌或真菌可以利用水中O2對有機污染物進行分解、轉化，產(chǎn)生CO2和上述營養(yǎng)物質(zhì)，以維持藻類的生長繁殖［4]。因此，菌藻組合體系治理鉻污染，可以利用菌藻兩類生物之間的生理功能協(xié)同作用，達到更加理想的去除污染物的效果［5]。

本研究從天津某印染廢水中篩選出兩種Cr（Ⅵ）耐受菌，將菌藻組合后降解Cr（Ⅵ）的效果更好。通過對菌藻混合體系的優(yōu)化，實現(xiàn)了在更短時間內(nèi)提高Cr（Ⅵ）去除率的效果，旨為進一步開展菌藻混合體系的應用提供理論依據(jù)并奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和微藻來源 實驗所用Cr（Ⅵ）去除菌分離自天津某印染廠印染廢水。羊角月牙藻（SelenastrumcapricornutumFACHB-271）購于中國科學院淡水藻種庫（FACHB）。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基配方依據(jù)參考文獻［6]配置。（2）BG-11培養(yǎng)基配方依據(jù)參考文獻［7]配置。

1.2 方法

1.2.1 Cr（Ⅵ）去除菌的篩選及鑒定 將2 mL印染廢水接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板中涂布劃線分離3次，28℃培養(yǎng)24 h，得到耐受Cr（Ⅵ）的菌株。將純化的菌株轉接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，在同樣條件下振蕩培養(yǎng)。每隔12 h取樣一次，8 000 r/min，離心5 min，測定上清液中Cr（Ⅵ）的濃度，篩選出高效去除Cr（Ⅵ）的細菌，并在-80℃冰箱中保存。

將篩選得到的菌株進行16S rRNA基因擴增分析，PCR引物經(jīng)華大基因公司測序后，將測序結果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號。再與EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫（http ：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）［8]典型菌株的16S rRNA基因進行比對，采用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.2 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）研究 將篩選出的兩株Cr（Ⅵ）高效去除菌以1∶1的比例加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，細菌接入總量為5%，與單獨細菌去除Cr（Ⅵ）效果進行比較。將混合菌分別以總接菌量為1%、3%、5%、7%及9%加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，對去除Cr（Ⅵ）效果進行比較。將羊角月牙藻培養(yǎng)至對數(shù)期（個數(shù)約為5×107個/mL）以不同接藻量與細菌混合加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培養(yǎng)基中，分別以細菌和單獨藻做對照，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。采用二苯碳酰二肼分光光度法［9]對鉻離子濃度進行測定，鉻的去除率參考文獻［10]中公式計算。微藻的葉綠素a的測定根據(jù)文獻［11]中的公式計算。

1.2.3 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）的條件優(yōu)化 采用三步法進行菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）去除的優(yōu)化研究。首先根據(jù)前期單因素實驗結果，利用Placket-Burman設計［12]，以Cr（Ⅵ）去除率為響應值，選出對菌藻體系去除Cr（Ⅵ）影響較大的3個因素。然后利用最陡爬坡設計得到最佳區(qū)域，最后利用Box-Behnken設計進行響應面法優(yōu)化和驗證［13]。通過實驗數(shù)據(jù)得到擬合響應面模型的最優(yōu)條件，并對最優(yōu)條件進行實驗驗證。數(shù)據(jù)處理采用Minitab17軟件進行分析。

1.2.4 粗酶液的制備及酶活性的測定 分別將兩株除鉻菌接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，參考文獻［14]制

2 結果

2.1 菌種的分離及鑒定

圖1 兩株細菌16S rRNA的PCR擴增電泳圖

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的效果

所以最終選取羊角月牙藻10%接藻量與混合菌混合進行后續(xù)優(yōu)化去除實驗。

圖3 菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）的去除情況

2.3 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）條件的優(yōu)化

2.3.1 菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的單因素試驗 分別以pH值、溫度、接菌量、NaCl濃度、重金屬離子和外加碳源作為單因素條件，考察Cr（Ⅵ）的去除效果。結果發(fā)現(xiàn)，菌藻混合體系在pH6.0時對Cr（Ⅵ）去除率最高，24 h達到84.3%，48 h達到95.6%（圖4-A）；在溫度33℃時對Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率達到95.9%（圖4-B）。當接菌量為5%時，對Cr（Ⅵ）去除效果最好，24 h去除65.3%，48 h達到了94.8%（圖4-C）。通過加入不同NaCl濃度發(fā)現(xiàn)，當NaCl濃度為1%時，對Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率達到96.5%（圖4-D）。外加1%（W/V））檸檬酸鈉、半乳糖、丙酮酸鈉、蔗糖及葡萄糖為碳源，以葡萄糖和丙酮酸鈉對Cr（Ⅵ）去除的影響最大（圖4-E）。分別選擇Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+和Mn2+作為金屬離子以10 mg/L的濃度加入培養(yǎng)基中，其中只有Cu2+對Cr（Ⅵ）的去除起促進作用，另外4種離子均起抑制作用（圖4-F）。

2.3.2 Placket-Burman實驗的優(yōu)化結果 Placket-Burman實驗設計表及實驗結果如表1所示，Minitab17軟件分析結果如表2所示。由分析可知，實驗得到的參照項P值為0，小于顯著性水平0.05，說明得到的回歸方程顯著，即該模型在整個回歸區(qū)域擬合性較好。溫度、Cu2+和葡萄糖3個因素對Cr（Ⅵ）去除率影響顯著。這3個因素進一步優(yōu)化表明，溫度對Cr（Ⅵ）去除率有顯著負效應，Cu2+和葡萄糖對Cr（Ⅵ）去除率有顯著正效應（表3）。剩下的影響因素中，pH值的P值為0.036，小于0.05，Cr（Ⅵ）去除率也有顯著性。其他因素的P值均大于0.05，對Cr（Ⅵ）去除率沒有顯著影響。

圖4 pH值（A）、溫度（B）、接菌量（C）、NaCl濃度（D）、外加碳源（E）、重金屬離子（F）對菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的影響

表1 Placket-Burman設計各因素與水平

2.3.3 最陡爬坡實驗結果分析 從表4中可以看出，第3組即溫度30℃，Cu2+30 mg/L，葡萄糖質(zhì)量濃度2%時Cr（Ⅵ）去除率最高，以此條件為中心點進行后續(xù)Box-Behnken響應面分析。

表2 Placket-Burman實驗設計及結果

2.3.4 Box-Behnken響應面實驗結果 以Cr（Ⅵ）去除率為響應值，以溫度、Cu2+濃度和葡萄糖含量設計三因素三水平響應面分析，結果見表5。利用Minitab17對15組試驗的響應值進行分析，得到二次多項式方程為：3.061X2X3。根據(jù)模型構建的方程做偏微分處理，求出模型中X1=-0.126 7，X2=-0.469 2，X3=0.204 1?？傻玫饺コ鼵r（Ⅵ）的最優(yōu)理論條件為：溫度29.74℃，Cu2+濃度27.65 mg/L，葡萄糖含量2.41%（W/V）時，由回歸方程得出的最優(yōu)Cr（Ⅵ）去除率為97.01%。

表3 Placket-Burman設計分析結果

表4 最陡爬坡試驗設計結果

表5 Box-Behnken設計及實驗結果

從表6中可看出，模型方程P值為0，證明該模型是顯著的，在回歸方程中對Y值影響是極顯 著 的，和X2X3對Y值影響是顯著的，其他幾項對Y值均不顯著。

由表7可知該模型顯著系數(shù)P值為0.003，＜0.01， 失 擬 項 系 數(shù)P值 為 0.302，＞0.05， 說 明該回歸模型擬合度好，無需再調(diào)整。其回歸系數(shù)R2=0.969 3，調(diào)整后為0.914 0，這兩個值都高于0.900，且較為接近，所以可以用該模型分析響應值。

表6 回歸實驗顯著性分析結果

表7 回歸方程方差分析

用Minitab17分析表5的試驗結果，得到響應曲面圖和等高線圖（圖5-圖7）。葡萄糖含量和Cu2+濃度，葡萄糖含量和溫度這兩組的交互作用對Cr（Ⅵ）去除影響較顯著（圖6和圖7）。最終，響應面法優(yōu)化后的菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的最佳反應條件為：29.74℃，Cu2+濃度為27.65 mg/L，葡萄糖含量為2.41%（W/V），丙酮酸鈉含量2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl濃度為0時，24 h內(nèi)菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）去除率達到97.89%。

2.3.5 驗證試驗 為了驗證擬合的回歸模型預測的準確性和有效性，按照優(yōu)化后的條件進行Cr（Ⅵ）的去除實驗。結果表明，菌藻混合體系在24 h時對Cr（Ⅵ）的去除率達到了97.89%，實驗值與預測值之間具有良好的擬合性，表明回歸方程可以比較真實的預測各個因素對菌藻體系去除Cr（Ⅵ）的影響。與優(yōu)化前的相比菌藻混合體系24 h內(nèi)對Cr（Ⅵ）去除率提高30%左右，優(yōu)化后去除效果明顯。

2.4 兩株細菌Cr（Ⅵ）還原酶活性測定

2.4.1 不同溫度和pH值對Cr（Ⅵ）還原酶的影響 從圖8-A中可以看出，兩株細菌Cr（Ⅵ）還原酶在20-50℃范圍內(nèi)的相對酶活都可達到80%以上，其中30℃時酶的相對活性最高。這與菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）去除效果最好時的溫度33℃基本一致。

不同pH值條件下兩株細菌胞內(nèi)Cr（Ⅵ）還原酶的相對活性結果如圖8-B所示。菌株S-3的Cr（Ⅵ）還原酶的最適范圍偏酸性，而D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適范圍偏堿性。如pH為8.0時，D-7 Cr（Ⅵ）還原酶相對活性達到了92.59%，而S-3只有77.43%。菌株S-3的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值為6.0，菌株D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值為7.0。

圖5 溫度和Cu2+濃度對Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖6 葡萄糖和Cu2+濃度對Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖7 葡萄糖含量和溫度對Cr（Ⅵ）去除率的曲面圖（A）和等高線圖（B）

2.4.2 Cr（Ⅵ）還原酶動力學曲線 不同Cr（Ⅵ）濃度下，菌株S-3和D-7 Cr（Ⅵ）還原酶動力學曲線如圖9所示。結果表明，菌株S-3 Cr（Ⅵ）還原酶 的Km=86.94 μmol/L，Vmax=2.71 μmol/（L·min），菌 株 D-7 Cr（ Ⅵ ） 還 原 酶 的Km=103.18 μmol/L，Vmax=3.38 μmol/（L·min）。

圖8 不同溫度（A）和pH值（B）條件下Cr（Ⅵ）還原酶的相對活性

圖9 菌株S-3（A）和D-7（B）Cr（Ⅵ）還原酶動力學曲線

3 討論

微生物修復技術在處理水體鉻污染方面具有突出的優(yōu)勢，越來越多的Cr（Ⅵ）還原菌被發(fā)現(xiàn)，如大腸桿菌（Escherichia coli）［15]、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［16]等。本實驗從印染廢水中篩選到兩株能夠去除Cr（Ⅵ）的細菌S-3和D-7，分別屬于沙雷氏菌屬（Serratia）和代爾夫特菌屬（Delftia）。二者混合后對Cr（Ⅵ）的去除效果比單一菌株的效果要好，說明兩種細菌對Cr（Ⅵ）的去除存在互相促進作用。菌藻之間的相互作用主要有信號傳導、營養(yǎng)交換和基因轉移3種方式，其中營養(yǎng)交換最為主要。藻類在自身代謝的過程中會分泌出許多可溶性有機物，如維生素、碳水化合物、肽，以及生長因子和促進因子等，分泌出的有機物中有些會被細菌利用用于自身生長［17]。目前已經(jīng)有很多菌藻共生的研究，可用于修復各種廢水。如劉玉沛［5]報道的小球藻與赤紅球菌固定后對苯酚的降解率比單獨赤紅球菌對苯酚的降解率提高了將近1倍。Safonova等［18]從石油污染的廢水中篩選得到的紅球菌，與小球藻作用能夠?qū)?.04 mg/L的Cu2+去除達到62%以上。將混合菌與羊角月牙藻以不同比例混合發(fā)現(xiàn)，當微藻接藻量為10%時去除效果最好，而接藻量達20%以上反而對Cr（Ⅵ）的去除起到了抑制作用。這可能是因為藻類自身的代謝過程會產(chǎn)生類黃酮類和縮酚酸等物質(zhì)［19]，當受到氧化脅迫時產(chǎn)生的防御性物質(zhì)［20]會對細菌起到一定的抑制作用［21]，進而對細菌去除Cr（Ⅵ）會有一定的影響。同時微藻的光合產(chǎn)氧降低了對氧氣供應的需求［22]。同時細菌通過提供CO2和其他刺激生長方式來促進微藻的光合自養(yǎng)［23]，廢水中的有害物質(zhì)會有效地去除。另一方面，細菌在生長過程中也會產(chǎn)生對微藻生長有影響的物質(zhì)，如Morel等［24]報道的Delftiasp.JD2在含有Cr（Ⅵ）的環(huán)境中培養(yǎng)可以生成IAA，可對微藻的生長起到促進作用。所以推測培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件雖然不適合羊角月牙藻的生長，但是細菌在生長過程中分泌出的物質(zhì)會為微藻提供營養(yǎng)，所以會使培養(yǎng)基中微藻葉綠素含量有適當?shù)纳摺?/p>

環(huán)境因素對菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）有一定影響。pH值影響微生物代謝過程中酶的活性進而影響自身的生長和污染物的去除［25]。本研究中的菌藻混合體系在較大的pH范圍內(nèi)能正常生長，推測該菌藻體系中的兩種細菌各自最適pH值疊加有較寬的適應范圍。溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素，最佳適應溫度30-35℃與已報道的Cr（Ⅵ）還原菌大多數(shù)細菌的最佳溫度相似［26]。碳源可為Cr（Ⅵ）提供電子供體，促進微生物對Cr（Ⅵ）的還原。本研究在添加葡萄糖和丙酮酸鈉后促進了Cr（Ⅵ）的還原，與潘翠等［27]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖可明顯促進芽孢桿菌菌株（Bacillussp.）對Cr（Ⅵ）的還原基本一致。細菌接菌量對Cr（Ⅵ）的去除有較為明顯的影響。因為細菌細胞密度與Cr（Ⅵ）的去除能力存在一定的關系［28]。Mabroukik等［29]報道的Streptomycessp.MS-2接種量在5%-15%范圍內(nèi)時，對Cr（Ⅵ）的還原率呈現(xiàn)增長趨勢。本研究中Cu2+對培養(yǎng)基中細菌生長有一定的影響，同時可對細菌中Cr（Ⅵ）還原酶起促進作用。已經(jīng)報道的許多抗Cr（Ⅵ）細菌都具有較強的耐鹽性［30]。本研究的兩種細菌對NaCl都有很好的耐受性，且在0-4%范圍內(nèi)，菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）的去除率都達到了90%以上。

響應面法在微生物降解去除污染物方面被廣泛使用。張海濤等［31]利用響應面法優(yōu)化菌株zhtI（Acinetobacter guillouiae）降解苯酚，降解率達到93.23%。賀強禮等［32]對菌株YH1（Pseudomonas corrugate）降解叔丁基鄰苯二酚進行響應面優(yōu)化，降解率可達98.21%。本研究通過響應面法優(yōu)化菌藻混合體系后，在提高Cr（Ⅵ）去除率的同時，縮短了處理時間。這在快速處理含鉻廢水，控制有效成本方面具有很好的借鑒意義。

溫度和pH值會影響酶的相對活性。如魏斐等［33]篩選出C-2蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensisC-2）中的還原酶最適pH值為7.0，并且在25-37℃范圍內(nèi)保持良好活性。Pal等［34]從土壤中篩選出的Bacillus sphaericusAND303中Cr（Ⅵ）還原酶的Km為 158.12 μmol/L，Vmax為 1 432 nmol/（L·min）。本研究中的S-3和D-7來自印染廢水，其Cr（Ⅵ）還原酶的酶促反應動力學常數(shù)與其他Cr（Ⅵ）還原菌存在一定差異，表明不同細菌Cr（Ⅵ）還原酶活性因其適應的生長環(huán)境不同而有一定差別。

4 結論

從印染廢水中篩選到兩株除Cr（Ⅵ）菌，經(jīng)16S rRNA鑒定分別屬于沙雷氏菌屬和代爾夫特菌屬，并且在等比例混合后去除Cr（Ⅵ）效果優(yōu)于單獨菌株的去除效果。菌藻混合體系中，羊角月牙藻以10%的接藻量去除Cr（Ⅵ）的效果最好。通過Placket-Burman實驗設計、Box-Behnken實驗設計及響應面法分析，確定菌藻混合體系去除Cr（Ⅵ）的最優(yōu)條件為：溫度29.74℃，Cu2+27.65 mg/L，葡萄糖2.41%（W/V），丙酮酸鈉2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl濃度為0時，24 h內(nèi)菌藻混合體系對Cr（Ⅵ）去除率達到97.89%。菌株S-3和D-7的Cr（Ⅵ）還原酶最適pH值分別為6.0和7.0。菌株S-3 Cr（Ⅵ）還原酶的Km為 86.94 μmol/L，Vmax為 2.71 μmol/（L·min），菌株D-7 Cr（Ⅵ）還原酶的Km為103.18 μmol/L，Vmax為 3.38 μmol/（L·min）。