王文婧 盧松霖 劉雪 李司宇 郝雪萌 李媛媛 張杰

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

重金屬污染是目前危害最大、面積最廣的環(huán)境問題之一［1]。而污染水體的重金屬主要包括生物毒性顯著的鉻、鎘、汞和鉛等［2]，其中鉻廣泛用于電鍍，制革和紡織染色木材處理等工業(yè)過程［3]。鉻在水中主要有六價鉻和三價鉻兩種存在形式，六價鉻的毒性很強(qiáng)，是三價鉻的100倍［4]，且六價鉻更易被人體吸收、蓄積而誘發(fā)多種疾病［5]。因此，研究如何高效地去除或還原水體中的六價鉻具有極為重要的意義。近年的研究表明，由于固定化微生物技術(shù)擁有二次污染小、環(huán)保經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用前景良好等優(yōu)點［6]，被廣泛應(yīng)用于重金屬污染，常用的固定化方法有交聯(lián)法、吸附法和包埋法等［7]。

包埋法是利用高聚物形成凝膠時將微生物包埋在載體中，或者是將微生物細(xì)胞分散到凝膠聚合物孔隙所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)空間中，從而將微生物細(xì)胞固定的方法［8]。包埋法具有減輕或耐受底物抑制的作用，有效地保持細(xì)胞的降解活性等優(yōu)點［9]。本研究利用硼酸與無水氯化鈣混合液作為交聯(lián)液，聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）和海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）的混合液作為凝膠基質(zhì)，通過兩種包埋方式，聚乙烯醇-海藻酸鈉（PVA-SA）和聚乙烯醇-海藻酸鈉-馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PVA-SAPDA），制備兩種 BSL01固定化孢子小球，對比兩種小球?qū)α鶅r鉻的還原效率、機(jī)械性能的差異，探究了包埋小球?qū)α鶅r鉻的還原效率及循環(huán)利用次數(shù)。本研究制備的固定化孢子小球，首次將活細(xì)菌和PDA培養(yǎng)基一起包埋在小球里，保證了小球里菌絲的活性，有利于增加還原的次數(shù)和還原效率，希望能為水體中六價鉻的處理提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的鉤狀木霉（BSL01）是利用六價鉻作為篩選條件，從東北林業(yè)大學(xué)林場的土壤中篩選出的對六價鉻耐受力較強(qiáng)的菌株，保藏于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室。

1.2 方法

1.2.1 包埋小球的制備 交聯(lián)劑的制備：稱取不同配比的硼酸和無水氯化鈣，按照馬志剛等［10]的方法制備成交聯(lián)劑，待用。

包埋小球的制備：選擇不同濃度配比的PVA和SA（表1），置于無菌水中，水浴加熱至75-85℃使其溶解，室溫放置12 h，再放置在75-85℃水浴鍋中加熱1 h，水浴加熱3次，最后一輪水浴時，待混合物的溫度降低至40℃左右，將混合物推到交聯(lián)劑中，觀察各組小球形態(tài)并測定各組小球機(jī)械性能。

表1 小球各組分含量

1.2.2 PVA-SA-PDA小球的制備 PDA的制備：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，投入蒸餾水中煮沸至能用玻璃棒戳破，過濾后加入葡萄糖20 g（固體PDA需加入瓊脂15 g），混勻，補(bǔ)水至1 000 mL，115℃高壓蒸汽滅菌 20 min［11]。

PVA-SA-PDA小球的制備：固體PDA冷卻至室溫后，用刀片將其切割成2 mm×2 mm×2 mm的立方體，用1.2.1中PVA-SA小球的制備方法將上述PDA小立方體包裹入包埋小球中，制備成PVA-SAPDA包埋小球。

1.2.3 BSL01孢子的固定 用1.2.1中的方法制備含有BSL01孢子的包埋小球。最后一輪水浴中，待混合物冷卻至約40℃時，加入BSL01分生孢子懸液（孢子懸液與混合物體積比為1∶10），混合均勻。將含有分生孢子的混合物推到交聯(lián)劑中，制備成含有BSL01孢子的PVA-SA和PVA-SA-PDA包埋小球，置于4℃下保存。將上述PVA-SA包埋小球接種到無菌的PDA平板中，放入培養(yǎng)箱中（30℃）培養(yǎng)3-5 d，觀察其生長狀況。

1.2.4 兩種BSL01包埋小球?qū)α鶅r鉻還原率的測定 將兩種包埋小球放入培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（pH 9.0，30℃，150 r/min）培養(yǎng)2-3 d，用去離子水洗滌3次，稱取20 g小球放入100 mL含有六價鉻的培養(yǎng)液中，六價鉻濃度為50 mg/L，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（30℃，150 r/min）培養(yǎng)，間隔24 h測定六價鉻的還原率。

1.2.4.1 消解菌絲 用消煮法消解菌絲，得到含鉻的待測溶液［12]。

1.2.4.2 六價鉻濃度的測定 利用二甲基苯碳酰二肼法測定上清液中六價鉻的含量，原子吸收分光光度計測定上清液中的總鉻含量，根據(jù)測得的總鉻含量和六價鉻含量的差值計算出上清液中三價鉻的含量。

1.2.5 兩種BSL01包埋小球重復(fù)使用次數(shù)及還原效率的測定 在無菌條件下，分別稱取PVA-SA和PVA-SA-PDA包埋小球20 g，放入含有六價鉻的100 mL培養(yǎng)液中，六價鉻濃度為50 mg/L，每12 h取樣一次，當(dāng)六價鉻被徹底還原時，用無菌水沖洗包埋小球，并將其投入到新鮮的含有六價鉻（50 mg/L）的100 mL培養(yǎng)液中，如此循環(huán)處理，直至菌絲體泄露。

2 結(jié)果

2.1 PVA-SA小球的制備

為了得到理想包埋條件，本研究通過正交試驗對包埋小球的硬度、成球性、通透度、彈性等機(jī)械性能進(jìn)行測定（表2）。

表2 各組小球的機(jī)械性能

本研究選擇硬度最大且透明的第9組實驗小球（由于兩種小球外觀差異并不明顯，以下所有附圖均為PVA-SA-PDA小球（圖1）。

圖1 形狀規(guī)則的包埋小球（A）形狀不規(guī)則的包埋小球（B）

2.2 固定化真菌對Cr（VI）還原特性

含有BSL01孢子的PVA-SA包埋小球的PDA平板在恒溫培養(yǎng)箱中（30℃）培養(yǎng)3-5 d后，菌落形態(tài)如圖2-A，菌絲結(jié)構(gòu)如圖3，可以看出，固定在PVA-SA小球中的BSL01孢子經(jīng)過培養(yǎng)后可以正常發(fā)育。

圖2 PVA-SA孢子球發(fā)育菌落（A）PVA-SA中BSL01菌體泄露（B）

圖3 光學(xué)顯微鏡下的BSL01菌絲（40X）

將含有BSL01孢子的PVA-SA和PVA-SA-PDA包埋小球投入只含有培養(yǎng)基的六價鉻濃度為50 mg/L的培養(yǎng)液中，由于營養(yǎng)過剩，第7天包埋小球裂解，菌體泄露，如圖2-B；投入到不含有培養(yǎng)基的六價鉻培養(yǎng)液中，由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，兩種包埋小球中，孢子生長均很緩慢，六價鉻還原效率也很低，分別為12.3%和23.7%（圖4-A）。為了找出兩種包埋小球還原六價鉻的最優(yōu)條件，本研究嘗試在培養(yǎng)液中添加不同濃度的培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基濃度為50%、六價鉻濃度為50 mg/L的培養(yǎng)液中，兩種包埋小球內(nèi)BSL01孢子能夠正常生長且菌絲體沒有出現(xiàn)泄露，同時六價鉻還原效率均可達(dá)到90%以上（圖4-B），在120 h時，PVA-SA包埋小球還原率為93.4%，PVA-SA-PDA包埋小球還原率為97.2%，可以看出，兩種還原小球單次利用時還原效果相差不大。

2.3 PVA-SA和PVA-SA-PDA包埋小球重復(fù)使用次數(shù)的測定

將兩種含有BSL01孢子的包埋小球分別投放到六價鉻濃度為50 mg/L、培養(yǎng)基濃度為50%的培養(yǎng)液中循環(huán)使用，發(fā)現(xiàn)PVA-SA包埋小球經(jīng)歷18次循環(huán)（圖5）之后，球體裂解，即PVA-SA包埋小球可重復(fù)利用18次，而PVA-SA-PDA包埋小球可以達(dá)到23個循環(huán)（圖6）。第一個循環(huán)時，PVA-SA包埋小球需要5 d將六價鉻完全還原，PVA-SA-PDA包埋小球需要5.5 d；第一個循環(huán)之后，還原速率加快，PVA-SA包埋小球從第8個循環(huán)之后，PVA-SA-PDA包埋小球從第9個循環(huán)之后，每個循環(huán)將六價鉻完全還原只需要3 d。每個循環(huán)開始時，培養(yǎng)液的pH值為9.0，循環(huán)結(jié)束后，培養(yǎng)液的pH值為5.3（圖7）。

圖4 PVA-SA-孢子和PVA-SA-PDA-孢子對六價鉻的還原率

圖5 PVA-SA包埋小球重復(fù)使用次數(shù)的測定

圖6 PVA-SA-PDA包埋小球重復(fù)使用次數(shù)的測定

3 討論

利用微生物將六價鉻還原為三價鉻是一種極具前景的方法［13]，具有成本低、環(huán)境友好、可持續(xù)利用等優(yōu)點。目前已分離出的能還原六價鉻的真菌有Fusariumsp.、Aspergillusflavus和Aspergillusniger等［14]。PVA-SA和PVA-SA-PDA兩種BSL01包埋小球內(nèi)的孢子均可以萌發(fā)生長形成菌絲，為去除六價鉻實驗奠定基礎(chǔ)。兩種小球在培養(yǎng)基濃度為50%的培養(yǎng)液中將六價鉻還原為三價鉻的效率最高，且不發(fā)生菌絲泄露，為后期包埋小球重復(fù)使用效率的測定奠定了實驗基礎(chǔ)。

在固定化小球重復(fù)使用效率的測定實驗中，每個循環(huán)結(jié)束之后，測得培養(yǎng)液的pH從9.0下降到了5.3，該結(jié)果與 Sanghi等［15]的研究相似，推斷原因可能是在培養(yǎng)真菌過程中有機(jī)酸代謝物的積累所致。此外，相對于PVA-SA固定化小球，PVA-SA-PDA固定化孢子球的還原效率和循環(huán)次數(shù)明顯增加，我們推測，PVA-SA-PDA小球內(nèi)培養(yǎng)基的存在，使孢子活性保持時間較長，因而該核殼結(jié)構(gòu)小球還原六價鉻的效率較高且循環(huán)次數(shù)增多。但是，還原機(jī)制目前不完全清楚。

圖7 包埋小球還原六價鉻過程中pH的變化

4 結(jié)論

本研究表明，通過PVA-SA，PVA-SA-PDA兩種包埋方式制備的兩種BSL01活菌固定化小球，還原六價鉻的效果顯著且能夠持續(xù)還原，且在PVA-SAPDA孢子小球中，由于培養(yǎng)基的存在，還原的效率更高且循環(huán)次數(shù)更多。