楊曉玫，師尚禮，姚 拓，呂丹彤，李 琦，李 東，楊芮淇，謝華山

(甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)為一種發(fā)光蛋白，1999年首次被報道[1]，其發(fā)射波長較長，最大吸收波長和最大發(fā)射波長分別為558 nm和583 nm，在紫外線的照射下可直接發(fā)射紅色熒光，其靈敏度比綠色熒光蛋白(GFP)及青色熒光蛋白(CFP)高，是基于GFP和CFP的一種優(yōu)良穩(wěn)定的熒光蛋白[2]。利用大腸桿菌DH5a法和三親本雜交法成功構建了穩(wěn)定表達的RFP熒光標記根瘤菌[3]，適度增加了熒光資源，可對不同顏色熒光質粒蛋白同時多部位標記[4-5]。豆科植物固氮效率的高低直接由豆科植物與根瘤菌兩者之間基因的相容性決定[6]，田間接種根瘤菌后，土著根瘤菌必然會與外源根瘤菌在生長空間，土壤營養(yǎng)及宿主植物等方面進行競爭，其競爭能力的大小直接影響接種的根瘤菌能否正常結瘤[7]。

目前，國內外對RFP質粒轉入苜蓿根瘤菌的研究鮮為報道，已有cfp基因成功導入苜蓿根瘤菌中，并有明顯的促生效果[8]。為檢測RFP質粒標記后的根瘤菌能否成功侵染苜蓿根系并結瘤，將含有RFP質粒穩(wěn)定表達的熒光標記根瘤菌接種于紫花苜蓿(Medicagosativa)，觀察導入的rfp質粒在苜蓿植物體內能否正常表達，并通過測定回接植株的生物量，結瘤特性和占瘤率探討優(yōu)良紅色熒光標記株的熒光蛋白表達能力，為研究根瘤菌結瘤固氮能力及根瘤菌與土著菌消長競爭關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

盆栽試驗種子發(fā)芽率90.6%、甘農5號和WL3436HQ紫花苜蓿凈度為98.5%，均來自草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室。

試驗培養(yǎng)基參照袁全等[9]的方法配制TY(Yeast Tryptone Agar)、參照殷愛華等[10]的方法配制YMA培養(yǎng)基，Hoagland無氮營養(yǎng)液[11]。

出發(fā)菌為課題組篩選的高效根瘤菌RhizobiummelilotiGN5(S.LZgn5)、Sinorhizobiummeliloti343(S.LH3436)，購自中國科學院微生物保藏中心的苜蓿中華根瘤菌標準菌Sinorhizobiummeliloti12531(S.12531)。

苜蓿幼苗接菌RFP基因質粒熒光標記根瘤菌菌株：S.LZgn5-rfp2，S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子表面滅菌 取出5粒滅菌甘農5號和WL343HQ苜蓿種子，用無菌水在滅菌三角瓶中將種子洗滌2次，75%的乙醇浸泡3 min，并用無菌水清洗4次。0.1%的HgCl2浸泡3 min，清洗4次。為檢測種子表面是否徹底滅菌，將之前的滅菌種子放于YMA培養(yǎng)基，觀察有無菌長出。

1.2.2 種子發(fā)芽處理 取表面滅菌的供試品種種子均勻置于滅菌培養(yǎng)皿內濾紙上，加入5 mL無菌水28℃避光培養(yǎng)，適時補充水分，待其發(fā)芽后選取發(fā)芽狀況一致的種子備用。實驗塑料杯(6 cm×7.5 cm)用75%乙醇處理后杯底扎眼，供給后期苜蓿的生長從下而上的營養(yǎng)液。高溫滅菌沙培沙子3 h，150℃高溫持續(xù)烘干6 h，冷卻后分別裝于塑料杯中，每標250 g，分別取20粒發(fā)芽種子均勻放于每杯中并覆沙20 g。

1.2.3 制備及接種菌液 分別用接種環(huán)轉接苜蓿根瘤菌及熒光標記菌至100 mL YMA液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min培養(yǎng)，定期檢測其D600 nm值，待值達到0.5～0.8時結束培養(yǎng)備用。

采用每菌株4次重復隨機區(qū)組[12]進行盆栽試驗，并設置不接菌處理作為對照。幼苗長出第一片真葉時，開始在白色培養(yǎng)盤中加入Hoagland無氮營養(yǎng)液。轉移已培養(yǎng)好的菌液至離心管離心，去上清留沉淀，加入等體積的無菌水，混合震蕩，每個盆栽表面分別澆灌20 mL。水分和營養(yǎng)液需在幼苗生長的整個過程中補充及時。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 苜蓿幼苗生長指標 苜蓿幼苗生長至第46 d，從杯中取出苜蓿幼苗及沙，沖洗干凈至根系完整分開，濾紙及時吸干表面水分。

(1)直尺測量苜蓿苗的株高和根長；(2)計數(shù)不同處理苜蓿葉片數(shù)；(3)采用描形稱重法[13]測定苜蓿葉片葉面積，選取植株從下往上第二個分枝中間的葉片3次重復；(4)分析天平分別稱量不同處理苜蓿幼苗地上鮮重和根鮮重，3次重復并記數(shù)；稱鮮重后放于烘箱110℃處理20 min，隨后立即80℃連續(xù)烘干12 h后稱其干重。

1.3.2 苜蓿固氮能力指標測定 (1)測定苜蓿幼苗單株結瘤數(shù)；(2)參照李劍峰等[14]5分制的方法劃分根瘤等級；(3)測定苜蓿幼苗根瘤固氮酶活性，采用乙炔還原法[15]；切下根系兩端0.5 cm處根瘤，并稱0.1 g鮮重，放于17 mL西林瓶中，并放入濕潤的濾紙片，蓋瓶塞并密封，3次重復處理，用微量2 mL無菌注射器抽出1.7 mL瓶內空氣，并注入1.7 mL乙炔氣體，使其終濃度為10%。室溫下反應1 h后，以100 μL進樣器抽取西林瓶內氣體50 μL，用GC-7890F氣相色譜儀測定各處理在1 h內生成的乙烯氣體含量(μmol)，參照譚志遠等[16]的方法計算植株根瘤的固氮酶活性(μmol/(h·g)；(4)苜蓿幼苗單株根瘤占瘤率的檢測。常規(guī)方法用滅菌培養(yǎng)皿收集所有根瘤，用熒光顯微鏡觀察表面滅菌的處理的苜蓿幼苗根瘤，熒光標記株侵染產生紅色熒光[17]。篩選出固氮酶活性高、占瘤率高且熒光蛋白表達能力高，同時增加苜蓿植株生物量的熒光標記菌株苜蓿幼苗。

1.3.3 測定苜蓿幼苗葉綠素含量 苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的測定參照鄒琦等[18]的方法，為取苜蓿幼苗各處理長勢甚微從上往下第2個分枝的苜蓿葉片，并稱取0.1 g剪碎，放于離心管中按方法步驟測定并計算葉綠素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結果單因素方差用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析[19]，數(shù)據(jù)的多重性用Duncan法比較，圖表均用Excel 2007制圖。

2 結果與分析

2.1 RFP熒光標記菌對2個苜蓿品種幼苗生物量的影響

生物量的大小通過其積累物質能力強弱充分反映，甘農5號苜蓿幼苗接種根瘤菌和接種紅色熒光標記根瘤菌后苜蓿幼苗根鮮重及干重、地上部分鮮重及干重均高于未接種的處理。其中，接種S.LH3436、S.12531、S.LZgn5、S.LH3436-rfp3、S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的苜蓿幼苗根鮮重高出對照15%～77%，根干重高出對照92%～66%，地上鮮重高出對照23%～58%，地上干重高出對照18%～78%，均具有顯著差異(P<0.05),表明S.LH3436、S.12531、S.LZgn5及其紅色熒光標記根瘤菌具有一定的促生作用(表1)。

接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的甘農5號苜蓿幼苗根鮮重、根干重、地上鮮重和地上干重分別比接種對應根瘤菌S.LH3436，S.12531和S.LZgn5高出2.6%～12.4%，3.2%～13.5%、1.4%～10.2%和1.8%～5.7%，差異均不顯著(P<0.05)，表明接種紅色熒光標記菌與接種對應根瘤菌相比無顯著影響，而與未接種對照相比生物量的增加有明顯促進效果，其中S.12531- rfp4表現(xiàn)較好。

表1 甘農5號苜蓿幼苗接種根瘤菌及紅色熒光標記根瘤菌的生物量

注：CK表示未進行接種處理，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同

苜蓿幼苗WL343HQ在接種紅色熒光標記根瘤菌后生物量均明顯提高。其中，苜蓿幼苗根鮮重及干重、地上鮮重及干重分別高出對照33%～73%、92.5%～98.2%、40%～73.4%和53.2%～90.1%，差異均顯著(P<0.05)。與接種對應根瘤菌相比，苜蓿幼苗接種S.12531-rfp4后的根鮮重及干重、地上鮮重及干重分別增加了0.42%、9.2%、2%和12%，而接種S.LH3436-rfp3和S.LZgn5-rfp2后的苜蓿幼苗根干鮮重和地上干鮮重有甚微減少，但無顯著差異，表明苜蓿幼苗WL343HQ接種紅色熒光標記根瘤菌后，不同標記根瘤菌的表現(xiàn)均無顯著差異，其中S.LH3436-rfp3表現(xiàn)較好(表2)。

表2 WL343HQ苜蓿幼苗接種根瘤菌及紅色熒光標記根瘤菌的生物量

2.2 熒光標記菌及對應出發(fā)菌株對兩品種苜蓿幼苗根長、株高等的影響

根長、株高、葉片數(shù)和葉面積直接影響著植株的生物量高低。甘農5號苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌后，增加了苜蓿幼苗根長、株高、葉片數(shù)及葉面積的大小，并有顯著差異(P<0.05)，其分別高出未接種對照的24.9%～50.4%、30.3%～57.7%、26.5%～44.6%和12%～14.5%。

甘農5號苜蓿幼苗接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后相比接種對應出發(fā)菌，接種熒光紅色熒光標記根瘤菌苜蓿幼苗的根長、株高、葉片數(shù)和葉面積分別高出3%、7.2%、3.66%和4.6%，無顯著差異，但接種紅色熒光標記苜蓿幼苗的根長高出未接種幼苗的19.7%，差異顯著(P<0.05)。其中，S.12531-rfp3表現(xiàn)較好(表3)。

苜蓿幼苗WL343HQ在接種紅色熒光標記菌后，幼苗根長、株高、葉片數(shù)和葉面積均有增加(表4)，分別高出未接種處理9.2%～48.7%、43.3%～69.9%、18.2%～28.6%和16.1%～24%，有顯著差異(P<0.05)。甘農5號苜蓿幼苗接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后的幼苗根長、株高、葉片數(shù)和葉面積分別比接種對應根瘤菌的出發(fā)菌高出13%、15.1%、11.1%和2.1%，但接種紅色熒光質粒的苜蓿幼苗根長高出對照的12.5%，差異顯著(P<0.05)。其中，以S.LH3436-rfp3表現(xiàn)較好(表4)。

2.3 熒光標記菌及其出發(fā)菌株對兩品種苜蓿幼苗固氮能力的影響

測定苜蓿根瘤固氮酶活性的高低是確認有效根瘤菌的傳統(tǒng)方法，直接反映苜蓿幼苗根瘤中根瘤菌固氮的能力強弱。甘農5號苜蓿幼苗接種紅色熒光標記根瘤菌S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2和接種對應根瘤菌的苜蓿幼苗單株結瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級均與未接種對照差異顯著(P<0.05)，其中，幼苗根瘤固氮酶活性是未接種處理的9.1～12.2倍，表明接種紅色熒光標記根瘤菌能增加根瘤的固氮酶活性，并和接種對應根瘤菌無顯著影響，以S.LZgn5-rfp2表現(xiàn)較好(表5)。

表3 甘農5號苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌后的根長、株高、葉片數(shù)和葉面積

表4 WL343HQ苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌后的根長、株高、葉片數(shù)和葉面積

表5 甘農5號苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌的的單株結瘤數(shù)、固氮酶活性、根瘤等級和標記菌占瘤率

注：占瘤率參照文獻[24]方法與50%進行比較，即50%為對照，對照的顯著水平為50%a

苜蓿幼苗WL343HQ接種紅色熒光標記根瘤菌和接種對應根瘤菌后，幼苗WL343HQ相應的單株結瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級均與未接種處理差異顯著(P<0.05)，其中，根瘤固氮酶活性是未接種的5.1～12倍，試驗表明苜蓿幼苗接種紅色熒光標記根瘤菌能顯著提高根瘤的固氮酶活性，并與接種對應根瘤菌無顯著差異。其中，以S.LH3436-rfp3固氮酶活性最高的表現(xiàn)好。

2.4 熒光標記菌及其出發(fā)菌株對兩品種苜蓿幼苗葉綠素的含量

葉綠素含量的高低反應了光合作用的強弱，也體現(xiàn)了植株利用氮素能力的強弱，RFP熒光標記菌分別接種的甘農5號紫花苜蓿的葉片葉綠素含量比對照高出40.2%～51.2%，差異顯著(P<0.05)，苜蓿幼苗接種紅色熒光標記根瘤菌及接種對應根瘤菌的葉綠素含量顯著高于未接種處理苜蓿(圖1)，但接種熒光標記根瘤菌與接種對應根瘤菌的苜蓿幼苗之間葉綠素含量無顯著差異。

表6 WL343HQ苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌的的單株結瘤數(shù)、固氮酶活性、根瘤等級和標記菌占瘤率

圖1 紅色熒光標記菌接種甘農5號苜蓿幼苗后的葉片葉綠素含量Fig.1 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of gannongno.5 after seedling leaf chlorophyll content

RFP熒光標記菌分別接種的紫花苜蓿S.12531的葉片葉綠素含量比對照高出38.2%～47.6%，差異顯著(P<0.05)。出發(fā)菌和熒光標記根瘤菌的葉綠素含量顯著高于未接種苜蓿，而出發(fā)菌和熒光標記根瘤菌之間葉綠素含量無顯著影響(圖2)。

3 討論

3.1 兩個苜蓿品種接種根瘤菌及紅色熒光標記根瘤菌生物量及生長指標

苜蓿的生物量和生長指標是直觀評價苜蓿品質的最重要因素，眾多學者研究結果報道，豆科植物產量可通過接種根瘤菌來增加[20]。目前，國內外都很重視根瘤菌的接種，多個國家在播種苜蓿前均先要進行根瘤菌接種處理，苜蓿在我國農業(yè)中有著不可替代的作用，從1981年開始一直篩選苜蓿根瘤菌優(yōu)良菌株，本研究中，3株根瘤菌與其紅色熒光標記菌接種的苜蓿幼苗地上鮮重和干重、根鮮重和干重、根長、株高等均顯著(P<0.05)高于未接種苜蓿幼苗，這也符合多位研究學者的成果，得出苜蓿幼苗接種紅色熒光標記菌和根瘤菌均對幼苗有明顯的促生作用，且紅色熒光標記根瘤菌對苜蓿幼苗根系無影響。

圖2 紅色熒光標記菌接種WL343HQ苜蓿幼苗后的葉片葉綠素含量Fig.2 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of WL343HQ after seedling leaf chlorophyll content

苜蓿根長、株高、葉片數(shù)和葉面積直接決定苜蓿的質量與產量，而熒光標記的轉入不影響苜蓿的正常生長[21]，檢測熒光標記菌的占瘤率均不能達到100%，說明存在其他根瘤菌，可能是苜蓿種子里攜帶的根瘤菌，伴隨種子萌發(fā)進入土壤根際，成為種子內生根瘤菌。熒光標記根瘤菌侵染苜蓿根系主要取決于根瘤菌細胞和質粒間的適當關系，兩者對生存空間和養(yǎng)分供給的不斷競爭的能力決定了熒光標記根瘤菌能否在植物根系形成有效根瘤[22-23]。紅色熒光蛋白質粒根瘤菌的接種對2種苜蓿的生長均無減緩影響，反而增加了苜蓿各生長指標的標準，對苜蓿品種的差別未有特異性，并有一定的促生效果，這也符合陳力玉等[8]的研究結果，熒光蛋白質粒標記根瘤菌不僅能直觀的觀測示蹤，還可提升苜蓿品質，是一種研究固氮機理等很有效直接的方法，為后期深入研究奠定基礎。

3.2 兩個苜蓿品種接種根瘤菌及紅色熒光標記根瘤菌固氮能力及葉綠素含量

固氮能力和植物葉綠素含量是對苜蓿的品質檢測，測定固氮能力等指標對比接種根瘤菌，方可得知紅色熒光蛋白質粒對苜蓿幼苗根瘤固氮能力有無影響，是否能繼續(xù)運用其進行深入研究。試驗中，設置表面滅菌且未接種紅色熒光的種子盆栽自生根系結瘤為對照組，接種紅色熒光蛋白的苜蓿盆栽根系結瘤為實驗組，均能在回接紅色熒光標記根瘤菌的苜蓿幼苗的根瘤中檢測出紅色熒光，篩選后的紅色熒光標記根瘤菌相比標準無顯著差異[24]，紅色熒光質粒導入根瘤菌并接種不同品種苜蓿幼苗不影響根瘤菌的競爭結瘤能力，并無負面影響。羅明云等[25]把luxAB基因導入花生根瘤菌中，檢測遺傳穩(wěn)定性及回接測定，并得出經過實驗結果分析luxAB基因不影響花生根瘤菌的正常生長及功能，試驗測定不同品種苜蓿幼苗接種紅色熒光標記根瘤菌固氮能力指標及葉綠素含量，可知紅色熒光質粒的根瘤菌能成功侵染苜蓿根系并結瘤，能在苜蓿幼苗體內正常表達，并對標記菌的結瘤無影響。

根瘤菌固氮作用固定的氮素提供苜蓿幼苗生長的氮源，而結瘤固氮的前提是共生的有效性，苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的多少能表征根瘤菌的共生有效性[26]。S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其紅色熒光標記根瘤菌接種的苜蓿葉片葉綠素含量與未接種處理相比有顯著差異(P<0.05),且與其對應的根瘤菌葉綠素含量無顯著差異，表明紅色熒光標記根瘤菌接種不同品種苜蓿后共生有效性良好，并無品種特異性。

4 結論

通過接種紅色熒光標記根瘤菌及其對應根瘤菌至甘農5號和WL3436HQ紫花苜蓿，研究其根瘤菌接種苜蓿幼苗的生物量及生長指標，結果表明接種紅色熒光標記根瘤菌對苜蓿幼苗的各項指標無不利影響，而表現(xiàn)出一定的促生效果，可促進苜蓿生物量的積累。研究S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其對應紅色熒光標記根瘤菌接種苜蓿幼苗與未接種苜蓿幼苗的固氮能力表現(xiàn)，結果表明接種根瘤菌與紅色熒光標記根瘤菌均能明顯提高苜蓿幼苗的固氮能力，和對應根瘤菌之間無顯著差異，以S.LH3436-rfp2和S.LH3436-rfp1較為突出。