張凱瑩 房付春,2 吳補領,2

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔科 廣州 510515；

2.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 廣州 510515

牙源性干細胞是從口腔組織中分離出來的成體干細胞，包括牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脫落乳牙干細胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、根尖乳頭干細胞（apical papilla stem cell，SCAP）、牙囊前體細胞（dental follicle progenitor cell，DFPC）、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）等，具有自我更新和多向分化的潛能[1]。在某些生物因素影響下，或當牙體組織受到創(chuàng)傷和不可逆性的齲病損害時，牙源性干細胞（尤其是DPSC）能分化為新的成牙本質細胞，分泌牙本質基質，進而形成修復性牙本質。

在體外特定條件下，培養(yǎng)的牙源性干細胞能分化為成牙本質樣細胞，具有高的克隆、增殖和形成致密鈣化克隆團甚至是鈣化結節(jié)的能力，此過程被稱為成牙本質向分化[2]。此過程涉及多種轉錄水平以及轉錄后水平調控機制[3]。研究牙源性干細胞成牙本質向分化機制為組織工程和再生醫(yī)學提供了新思路。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質對細胞生命過程起調控作用的RNA，目前研究較多的ncRNA包括了長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA/miR）、環(huán)狀RNA（circle RNA，circ-RNA）、Piwi-interacting RNA（piRNA）等。其共同點是能從基因組上轉錄而來，但是不翻譯成蛋白質，在RNA水平上行使各自的生物學功能[4]。近年來，關于ncRNA在膀胱、直腸等組織器官的作用機制的研究開展得比較廣泛，特別是在癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面研究得比較深入[5-6]。雖然ncRNA在牙源性干細胞中功能和機制的探討較少，但事實上ncRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化作用中發(fā)揮了重要作用，其往往通過成牙本質相關基因或相關通路發(fā)揮調控作用（表1）。

表1 ncRNA參與牙源性干細胞成牙本質向分化調控Tab 1 Regulation of ncRNAs on odontoblastic differentiation of dental tissue-derived stem cells

1 lncRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化中的作用

lncRNA轉錄本長度超過200核苷酸（nucleotide，nt），有的甚至超過10 000 nt，數(shù)量占ncRNA的80%以上。lncRNA通過與DNA/RNA或者與蛋白質結合，在轉錄及轉錄后水平上調節(jié)編碼蛋白質的基因的表達[7-8]，改變干細胞多向分化的能力，最終影響細胞的增殖、分化，乃至機體的生長、發(fā)育、衰老、死亡等重要生命活動以及疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。

在細胞質中，lncRNA的功能和潛在機制包括：調節(jié)信使RNA（messenger RNA，mRNA）的穩(wěn)定性，調節(jié)翻譯過程，作為競爭性內源RNA，作為miRNA的前體，調節(jié)蛋白質修飾過程[10]。

在細胞核中，lncRNA的調節(jié)機制包括：作為轉錄因子等調節(jié)蛋白的誘餌，作為RNA蛋白復合物的支架，通過招募染色質修飾因子成為表觀遺傳調控因子[11]。

1.1 lncRNA在人牙源性干細胞成牙本質向分化中的作用

2012年，Kretz等[12]發(fā)現(xiàn)了一種lncRNA，在人外胚層細胞分化時下調，并且需要保持外胚層干細胞或成骨細胞處于未分化的狀態(tài)，將其命名為反分化非編碼RNA（antidifferentiation non-protein coding RNA，ANCR），后更名為拮抗分化非編碼RNA（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR）。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)，下調的DANCR可通過作用于靶基因果蠅zeste基因增強子同源物2（enhancer of zestehomolog 2，EZH2）以及調控RUNT相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表達來促進成骨分化。Chen等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)，上調的DANCR顯著降低了糖原合成酶激酶3β的絲氨酸磷酸化（Ser9 phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達，提示DANCR可通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的活性進而抑制成牙本質向分化。

另外，lncRNA H19是轉錄自人類染色體11p15.5的H19/lgf2基因族的lncRNA，在細胞核和細胞質中均發(fā)揮多種功能活性[15]。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19可以與S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH）作用，H19/SAHH途徑調控DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）3B介導的同源盒轉錄因子（distal-less homeobox，DLX）3的基因甲基化和表達，從而在表觀遺傳水平促進DPSC成牙本質向分化。而Li等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19可競爭性結合miR-141，并阻止精子相關抗原（spermassociated antigen，SPAG）9發(fā)生miR-141介導的降解，從而提高p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化水平，進而促進人SCAP成骨/成牙本質向分化。

此外，也有學者[18]發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，人DPSC成骨/成牙本質向分化下調；進行ncRNA表達譜生物學分析，結果顯示20個lncRNA表達上調，27個lncRNA表達下調；構建lncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡，篩選出關鍵lncRNA 6-12白血病分子（six-twelve leukemia，STL），驗證了沉默STL將抑制成骨/成牙本質向分化，并可能通過醌還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶[nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): quinone oxidoreductase，NQO]1及內質網(wǎng)氧化還原酶（endoplasmic reticulum oxido re ductin，ERO）1發(fā)揮作用。

因此，lncRNA在人牙組織來源干細胞分化過程中的調控機制以及調控的多條途徑之間的關聯(lián)可能成為今后的研究熱點。

1.2 lncRNA在小鼠牙間充質干細胞成牙本質向分化中的作用

2016年，Zheng等[19]研究了與小鼠牙間充質干細胞成牙本質向分化相關的lncRNA，利用RNA測序比較新鮮分離的與培養(yǎng)的牙髓間充質干細胞的lncRNA表達譜，對差異表達的lncRNA與編碼RNA進行共表達分析，發(fā)現(xiàn)在新鮮分離的牙髓間充質干細胞中，共有108個lncRNA上調表達，36個lncRNA下調表達。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定可知，培養(yǎng)的與新分離的牙髓間充質干細胞相比，在培養(yǎng)的牙髓間充質干細胞中，母系印記基因3（maternally imprinted genes 3，Meg3）、肺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-asso ciated lung adenocarcinoma transcript 1，Malat1）、 X（染色體）失活特異性轉錄物（X-inactive specific transcript，Xist）和反義遠端同源盒轉錄因子1（distal-less homeobox 1 antisense，Dlx1as）等與成牙本質向分化相關的基因顯著下調，而在具有較強成牙本質向分化潛能的牙源性牙髓間充質組織中表達上調。提示lncRNA失調可能與牙間充質干細胞培養(yǎng)過程中成牙本質向分化潛能的喪失有關。此外，Dlx1上游生長因子成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）8可誘導牙髓間充質干細胞中Dlx1as的下調和Dlx1的上調，這表明Dlx1as與牙髓間充質干細胞中的Dlx1含量呈負相關，因此Dlx1和Dlx1as的表達可能存在相反的功能表型。

2 miRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化中的作用

miRNA是一類廣泛存在于真核生物基因組，長度為20～24 nt的內源性非編碼蛋白質的單鏈小分子RNA[20]。在產生miRNA的經典途徑中，存在于細胞核中的原始miRNA（pri-miRNA）能被核糖核酸酶Ⅲ Drosha和狄喬治氏綜合征相關蛋白8抗體（DiGeorge syndrome-related proteins 8 antibody，DGCR8）識別并裂解為前體miRNA（pre-miRNA），經RNA酶ⅢDicer進一步處理成為成熟miRNA[21]。研究[22]顯示，成熟miRNA通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)堿基互補配對結合，導致mRNA降解或者翻譯過程受到抑制，從而負調控靶基因的表達。在人類基因組中，大約1 000種miRNA被鑒別出，人類多達30%的基因受miRNA所調節(jié)[23-24]。

2.1 miRNA在人牙源性干細胞成牙本質向分化中的作用

近年已有研究表明部分miRNA可促進人牙源性干細胞成牙本質向分化。Xu等[25]研究在低濃度腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α介導下，miR-21和信號轉導與轉錄激活因子（transducer and activator of transcription，STAT）3表達上調，上調的miR-21協(xié)同STAT3來調控人DPSC成牙本質向分化，構成miR-21/STAT3信號通路。也有研究[26]發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4發(fā)生解離，從而抑制轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β信號通路的細胞內效應器Smad3，進而促進人DPSC成牙本質向分化。

此外，部分miRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化過程中表達下調。有學者研究miR-143-5p抑制成牙本質向分化的相關機制。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)，下調的miR-143-5p可降低與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）14的結合，促進MAPK14表達，激活p38 MAPK信號通路以促進成牙本質向分化。Zhang等[28]探究miR-143-5p在人DPSC成牙本質向分化中通過骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand，RANKL）信號通路直接作用于RUNX2的機制。雙熒光酶素報告顯示，RUNX2是miR-143-5p的直接作用靶基因；進一步實驗顯示，在轉染了pMIR-miR-143-5p抑制體質粒的人DPSC中，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達活力增強，鈣化結節(jié)形成增多，牙本質磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本質基質蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、RUNX2和OPG表達上調，而RANKL表達下調，細胞侵襲遷移能力以及黏附能力增強，提示下調的miR-143-5p通過OPG/RANKL信號通路上調RUNX2的表達，進而促進人DPSC成牙本質向分化。此外，在IGF1處理的人SCAP中，hsa-let-7c可通過胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）-1/胰島素樣生長因子-1受體（insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R）/hsa-let-7c軸，抑制JNK和p38 MAPK信號通路，進而抑制成牙本質向分化[29]。

2.2 miRNA在小鼠牙間充質干細胞成牙本質向分化中的作用

在小鼠模型中，Li等[30]發(fā)現(xiàn)miR-3065-5p在成牙本質向分化過程中上調。雙熒光酶素報告顯示，miR-3065-5p與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ型（bone mor phogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）的3’端相結合，BMPR2在成牙本質向分化早期表達增多，而在晚期則表達劇烈下降。由此證實了小鼠模型中miR-3065-5p可部分通過BMPR2調控成牙本質向分化。

3 circRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化中的作用

circRNA是一類特殊的ncRNA分子，大量存在于真核細胞中，是由前體mRNA通過特殊的選擇性剪切產生的，與傳統(tǒng)線型RNA不同，呈封閉環(huán)狀結構，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩(wěn)定，因此成為新的生物學標記物[31]。

目前關于circRNA在人DPSC成牙本質向分化中的功能及機制的探討較少，尚停留在小鼠模型上，且多以基因芯片和生物信息學分析為主，但伴隨著新的研究技術體系的建立，circRNA在人DPSC成牙本質向分化中的機制將進一步得以闡明。占云燕等[32]對小鼠牙乳頭細胞向成牙本質細胞分化過程中的circRNA的表達譜進行了研究，發(fā)現(xiàn)在經礦化誘導的牙乳頭細胞中，差異表達的circRNA共4 064條，其中3 255條上調表達，809條下調表達。分析其中上調circRNA來源基因，發(fā)現(xiàn)很多基因與牙的發(fā)育過程及硬組織礦化相關。

4 ncRNA在牙源性干細胞成牙本質向分化中的研究展望

綜上所述，牙源性干細胞的成牙本質向分化會受到多種ncRNA的調控，兼有抑制或促進效應，其機制既包括直接作用于成牙本質向分化相關轉錄因子，也有間接作用于轉錄因子相關因素，甚至構成反饋環(huán)路發(fā)揮調控作用。lncRNA、miRNA和circRNA關系密切，它們彼此相互作用，在人體內構成一個復雜而精準的網(wǎng)絡調控體系。近年來關于內源性競爭RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）的作用機制探討較多，lncRNA和circRNA甚至某些miRNA均可發(fā)揮miRNA分子海綿作用，調控宿主基因表達[31,33-34]。筆者認為，關于ncRNA對成牙本質向分化的相關調控因素作用方面的研究，不僅有助于深入探究ncRNA這一參與許多重要生命活動的調控因子，也將有利于為牙源性干細胞的再生治療提供新的思路和方法。另外，關于尋找ncRNA結構和功能的更高效的研究方法，也將會成為ncRNA今后的研究熱點和重點。