鄒曉萍，葉豪奕，回月彤，商崇智，董化江，王 磊，徐 健※

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 a.婦產(chǎn)科，b.神經(jīng)外科，天津 300161； 2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津 300189；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

卵巢扭轉(zhuǎn)為女性臨床的常見(jiàn)病癥，如處理不及時(shí)可出現(xiàn)卵巢梗死或卵巢破裂，臨床可見(jiàn)于劇烈運(yùn)動(dòng)后、血管外腫瘤的壓迫，腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、嵌頓疝時(shí)腸系膜靜脈和動(dòng)脈受壓等情況?；謴?fù)血流灌注是有效的治療方法[1-2]。但扭轉(zhuǎn)的卵巢恢復(fù)正常解剖位置后，重獲血供的卵巢組織損傷程度比單純?nèi)毖獱顟B(tài)更為嚴(yán)重[3-5]。對(duì)于卵巢恢復(fù)血供后的再灌注損傷頗為棘手，尚無(wú)特效措施。通常給予患者對(duì)癥支持及抗炎治療，但往往給患者留下一定的后遺癥，甚至導(dǎo)致不孕，因此需引起高度重視。近年來(lái)，干細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，在很多疑難雜癥的治療上顯示出相當(dāng)優(yōu)勢(shì)，治療效果明顯[6-8]。不同學(xué)者對(duì)干細(xì)胞的治療機(jī)制持有不同的態(tài)度，目前干細(xì)胞發(fā)揮治療效用的主要作用機(jī)制有細(xì)胞替代和干細(xì)胞的分泌或代謝“副產(chǎn)品”的“偽旁觀(guān)者效應(yīng)”[9]。本研究選用細(xì)胞更為原始，且采用比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞分化能力更強(qiáng)的臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-matrix stem cells,UC-MSCs)作為治療的“種子細(xì)胞”。本研究利用UC-MSCs作為“種子細(xì)胞”應(yīng)用于卵巢扭轉(zhuǎn)模型干預(yù)卵巢組織的再灌注損傷，以探討UC-MSCs對(duì)為卵巢缺血再灌注的治療作用。

1 材料與方法

1.1“種子細(xì)胞”的采集及質(zhì)量控制 本研究使用的臍帶來(lái)源于武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院特色醫(yī)學(xué)中心收入的孕產(chǎn)婦。臍帶的獲取經(jīng)產(chǎn)婦本人及家屬同意并告知應(yīng)用于相關(guān)的科學(xué)研究，孕婦本人及家屬同意并了解后續(xù)用途后簽訂知情同意書(shū)。采集臍帶干細(xì)胞后用無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，CD73與CD105雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為95.5%、CD90陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為96.2%，CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<3%，見(jiàn)圖1；細(xì)胞活力≥95%，病原菌排查未檢出細(xì)菌，培養(yǎng)至第3～4代時(shí)使用。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雌性無(wú)特定病原菌級(jí)C57BL/6NCrl小鼠購(gòu)自華阜康生物科技股份有限公司(北京)，品系編碼：213，體重18～23 g。分籠喂養(yǎng)，每日日光燈照射時(shí)間控制為12 h，室溫控制在18.5～21.5 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境濕度控制在38.8%～43.5%，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程動(dòng)物自由飲食，保證充足飲水。

1.3主要儀器及藥品 UC-MSCs培養(yǎng)基(美國(guó)Lonza公司生產(chǎn)，批號(hào)：YS000235)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(美國(guó)Gibico公司生產(chǎn)，批號(hào)：K25772)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體(美國(guó)Gibico公司生產(chǎn)，批號(hào)：SP0810)；thermo實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)(美國(guó)Thermo Electron公司生產(chǎn)，批號(hào)：75002493)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER公司，型號(hào)：BD400)，4%多聚甲醛(上海樊克生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：P0099)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：Q223-01)，磷酸鹽緩沖液(北京生東科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：BP0002)。

1.4主要的實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字法將30只C57BL/6NCrl 小鼠分為3組：假手術(shù)組、卵巢缺血+再灌注損傷組(模型組)和卵巢缺血+再灌注損傷+UC-MSCs組(干細(xì)胞組)，每組10只。假手術(shù)組：在卵巢動(dòng)脈僅穿線(xiàn)，不阻斷血液灌流，縫合肌肉、皮膚；模型組：在假手術(shù)操作的前提下結(jié)扎卵巢動(dòng)脈，阻斷卵巢血液供應(yīng)30 min，后剪斷結(jié)扎線(xiàn)恢復(fù)卵巢血液供應(yīng)；干細(xì)胞組：結(jié)扎卵巢動(dòng)脈30 min后恢復(fù)血流灌注，并于恢復(fù)血流灌注后24 h通過(guò)向尾靜脈注射1.0×106UC-MSCs；模型組給予與干細(xì)胞組UC-MSCs同體積的0.9% NaCl注射液。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等技術(shù)檢測(cè)各組缺血卵巢組織內(nèi)VEGF和TNF-α 在分子水平及蛋白水平的表達(dá)差異。術(shù)后3 d 處死動(dòng)物，取手術(shù)側(cè)C57BL/6NCrl小鼠卵巢。

1.4.1血清TNF-α的測(cè)定及卵巢組織TNF-α及VEGF mRNA檢測(cè) 術(shù)后10 d眼球靜脈取血，以離心半徑20 cm，3 000 r/min，離心5 min，去上清，然后按照TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒相應(yīng)說(shuō)明書(shū)逐步操作。應(yīng)用TRIZOL(Total RNA Isolation)試劑提取創(chuàng)傷區(qū)卵巢組織總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄NDA。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共 29個(gè)循環(huán)，72 ℃ 再延伸10 min。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用快速凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜條帶，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值。TNF-α引物序列如下：TNF-Rat-F：CCCAATCTGTGTCCTTCTAACT；TNF-Rat-R：CAGCGTCTCGTGTGTTTCT(105 bp)；ACTB-Rat-F：GTGTGGATTGGTGGCTCTATC；ACTB-Rat-R：CAGTCCGCCTAGAAGCATTT(122 bp)。

1.4.2手術(shù)側(cè)卵巢組織TNF-α及VEGF變化情況 取三組小鼠手術(shù)側(cè)卵巢組織，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，去除表面的血液成分和覆膜。加入2 mL體積比為99∶1的細(xì)胞裂解液與蛋白磷酸酶混合物，迅速使用液氮進(jìn)行研磨，然后4 ℃離心，以離心半徑20 cm，15 000 r/min，離心20 min，倒棄離心后的上清剩余物質(zhì)為卵巢組織總蛋白。三組總蛋白各取總蛋白樣本25 μg，電泳、轉(zhuǎn)模，蛋白封閉6～8 h。與相應(yīng)的TNF-α及VEGF抗體孵育，與第二抗體 26 ℃孵育2 h。

1.4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到達(dá)預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)后，采用安樂(lè)死的方法處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。取各組損傷側(cè)卵巢組織，300目篩網(wǎng)研磨，制成單細(xì)胞懸液，然后取異硫氰酸熒光素、別藻青蛋白、多甲藻葉綠素蛋白抗體進(jìn)行CD90、CD73、CD105染色，按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取流式抗體0.5 μL，磷酸鹽緩沖液+2%血清3.5 μL染色30 s，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1三組實(shí)驗(yàn)大鼠卵巢組織中TNF-α mRNA和VEGF mRNA及其蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組、干細(xì)胞組小鼠卵巢組織的TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、VEGF mRNA及VEGF蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，干細(xì)胞組TNF-α mRNA、TNF-α蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)；VEGF mRNA及VEGF蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2～3。

組別只數(shù)TNF-α mRNATNF-α蛋白VEGF mRNAVEGF蛋白假手術(shù)組100.19±0.040.23±0.100.26±0.110.19±0.09模型組 100.57±0.19a0.65±0.21a0.29±0.13a0.22±0.09a干細(xì)胞組100.31±0.16ab0.21±0.07ab0.70±0.23ab0.58±0.24abF值3.1732.7652.1682.243P值0.0070.0090.0420.009

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；a與假手術(shù)組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

2.2各組血清中TNF-α蛋白水平比較 假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞組TNF-α蛋白水平分別為(0.435±0.012) pg、(5.232±1.320) pg、(1.439±0.508) pg，三組TNF-α蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.886，P<0.001)。模型組、干細(xì)胞組TNF-α蛋白水平較假手術(shù)組升高(P<0.01)；干細(xì)胞組TNF-α水平較模型組降低(P<0.01)。

2.3各組卵巢組織內(nèi)UC-MSCs數(shù)量的比較 假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞組UC-MSCs的數(shù)量分別為(0.091±0.034)%、(0.134±0.081)%、(3.176±0.936)%。三組大鼠UC-MSCs的數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.310，P<0.001)。模型組大鼠UC-MSCs的數(shù)量與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干細(xì)胞組UC-MSCs的數(shù)量高于假手術(shù)組和模型組(P<0.05)。

3 討 論

卵巢扭轉(zhuǎn)為女性臨床的常見(jiàn)病癥，但若處理不及時(shí)或不恰當(dāng)，輕則可出現(xiàn)輸卵管粘連、堵塞，重則可出現(xiàn)卵巢梗死、破裂等。卵巢扭轉(zhuǎn)臨床可見(jiàn)于劇烈運(yùn)動(dòng)后、外腫瘤的壓迫，腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、嵌頓疝時(shí)腸系膜靜脈和動(dòng)脈受壓等情況[1-3]。重建血流灌注是卵巢扭轉(zhuǎn)的有效治療方法,而扭轉(zhuǎn)的卵巢恢復(fù)正常的解剖位置后，雖然血液供應(yīng)得到恢復(fù)，但恢復(fù)血流灌注后會(huì)出現(xiàn)較前期單純?nèi)毖鼮閲?yán)重的損傷，因此對(duì)卵巢扭轉(zhuǎn)的缺血再灌注損傷的科學(xué)處理對(duì)患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸具有重要的臨床意義[3-5]。

MSCs是一類(lèi)具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，有體內(nèi)外擴(kuò)增培養(yǎng)和多向分化的潛能，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及多種疑難雜癥的治療方面具有廣闊的前景[6-9]。各種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子和外泌體主要通過(guò)改善卵巢組織微環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)卵泡發(fā)育或分化為顆粒細(xì)胞，恢復(fù)卵巢早衰患者的卵巢功能及生育能力[10]。另有研究證實(shí)，UC-MSCs 及骨髓來(lái)源的MSCs培養(yǎng)上清所提取的細(xì)胞外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)血清中各激素水平而促進(jìn)卵泡發(fā)育，有效降低順鉑對(duì)卵巢的損傷和破壞，明顯修復(fù)卵巢的功能[11]?？梢?jiàn)，MSCs可有效修復(fù)受損卵巢組織?；诖?，本課題選用無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議、細(xì)胞增殖和分化能力強(qiáng)、擴(kuò)增速度快的UC-MSCs作為種子細(xì)胞[6,8,12]，探討對(duì)卵巢扭轉(zhuǎn)小鼠的治療效果。

有文獻(xiàn)報(bào)道，UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)特性強(qiáng)，在自身免疫疾病治療和炎癥的調(diào)節(jié)方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在臨床上治療自身免疫性疾病、移植物抗宿主疾病、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面效果顯著[8-9,13]。同時(shí)MSCs本身又可分泌多種具有生物活性物質(zhì)、外泌體、酶類(lèi)等，而這些物質(zhì)本身具有良好的治療效果[9,13]。可見(jiàn)，UC-MSCs的治療作用可能既包括損傷細(xì)胞的替代作用，又包括細(xì)干細(xì)胞代謝產(chǎn)物的“旁觀(guān)者效應(yīng)”。MSCs所分泌的生物活性物質(zhì)可在促進(jìn)血管再生及血管生成、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮強(qiáng)大的作用[14-15]。MSCs外泌體在調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，外泌體囊泡內(nèi)含MSCs源mRNA、微RNA、酶等成分，這些物質(zhì)均參與受損組織的修復(fù)[16]。UC-MSC修復(fù)損傷的作用機(jī)制主要包括損傷細(xì)胞的替代作用、MSCs的分泌作用、促進(jìn)血管再生與重建等[17-19]。本研究選用C57BL/6NCrl小鼠模型，成功復(fù)制卵巢缺血再灌注模型，給予UC-MSCs進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)VEGF明顯增加，對(duì)恢復(fù)受損卵巢組織功能、維持血供具有重要意義；同時(shí)，在缺血再灌注損傷發(fā)生的病理生理過(guò)程中，炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大進(jìn)一步加重受損卵巢組織的“熱反應(yīng)”，需要在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)方面給予相應(yīng)的干預(yù)，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5,20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UC-MSCs治療可降低TNF-α表達(dá)。

綜上所述，UC-MSCs既可下調(diào)TNF-α的表達(dá)，又可有效加速治療性血管再生，有效促進(jìn)受損卵巢組織的功能恢復(fù)。