于魯華，劉琳，呂芳，彭小彧，呂曉芹，趙一燕，張樹紅，張樹成，王寧，張曉梅*

(1.大連醫(yī)科大學(xué)，大連 116044；2.揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州 225001；3.江蘇省蘇北人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，揚(yáng)州 225001；4.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021；5.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

隨著二胎政策的放開，不孕不育癥的發(fā)病率不斷上升，越來越多的人需借助輔助生殖技術(shù)(ART)如體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)來滿足生育需求。既往研究更重視女性引起的不孕，但是在不孕不育病因中男性因素約占50%，且15%的男性不育患者精液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果正常[1]，精液常規(guī)分析僅能反映48%男性的生育能力，而精子DNA完整性檢測(cè)可以有效補(bǔ)充傳統(tǒng)精液分析的不足[2]。關(guān)于精子DNA完整性及不同水平精子DNA碎片率(DFI)下不同受精方式對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響目前尚無統(tǒng)一定論。本研究回顧性分析2016年8月至2017年12月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院生殖中心接受IVF/ICSI助孕的667例不育夫婦的臨床資料，探討不同精子DFI及不同受精方式對(duì)凍融胚胎移植(FET)周期妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

以2016年8月至2017年12月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院我院生殖中心接受IVF/ICSI助孕的667對(duì)不育夫婦(女方667個(gè)周期)的臨床資料為研究對(duì)象，包括IVF 419個(gè)周期、ICSI 248個(gè)周期。根據(jù)不同精子DFI水平將研究對(duì)象分為兩組：低DFI水平組(低DFI組：DFI≤30%，439個(gè)周期)和高DFI水平組(高DFI組：DFI>30%，228個(gè)周期)；并根據(jù)不同的受精方式將兩組再分為兩個(gè)亞組：常規(guī)IVF組(IVF組)及ICSI組，比較不同水平精子DFI及在不同受精方式(IVF/ICSI)對(duì)FET周期妊娠結(jié)局的影響。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單純男方因素，包括性功能異常、輕中度少弱畸精子癥、免疫因素等；(2)女方子宮形態(tài)及排卵無異常；(3)雙方染色體無異常，無嚴(yán)重影響妊娠的內(nèi)外科疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)男性嚴(yán)重畸形精子癥者；(2)女性患有子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征(PCOS)者；(3)因預(yù)防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)、突發(fā)疾病、內(nèi)膜因素等原因取消新鮮周期而行全胚冷凍者。

二、研究方法

1.精子DNA完整性檢測(cè)：采集男方精液后，先用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(Sperm chromatin structure analysis，SCSA)即利用吖啶橙染色質(zhì)特異性來檢測(cè)正常精子與DNA受損精子的方法[3]來處理精液樣本，再將精液樣本用400 μl酸化溶液(0.1%TritonX-100、0.15 mol/L NaCl、0.08 mol/L HCl配置，PH=1.2)處理，30 s后與1.2 ml染色緩沖液(6 μg/ml吖啶橙AO、37 mmol/L枸櫞酸緩沖液、126 mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液、1 mmol/L EDTA、0.15 mol/L NaCl配置，PH=6.0)均勻混合，再放入FACS杯狀流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，CA，美國)檢測(cè)。為建立最佳的樣本流場(chǎng)，在樣本放置3 min左右進(jìn)行AO染色，并通過FACS掃描和數(shù)據(jù)分析軟件(DFIView 2010 Alpha11.15，CellProBiotech)對(duì)樣本相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2.促排卵方案及IVF/ICSI：女方采用長(zhǎng)方案促排卵：黃體中期采用GnRH-a降調(diào)節(jié)，降調(diào)節(jié)完成后在下次月經(jīng)周期的第5天開始用外源性Gn誘發(fā)排卵，根據(jù)卵巢反應(yīng)性調(diào)整藥物劑量，直到HCG日停用GnRH-a。陰道B超下監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)直徑大于18 mm的卵泡數(shù)目≥2個(gè)時(shí)，當(dāng)日21∶00左右予HCG(默克，瑞士)10 000 U肌肉注射，36 h后在B超引導(dǎo)下穿刺取卵。將取出的卵母細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中3～6 h，待其成熟后加入適量精液繼續(xù)培養(yǎng)。ICSI操作：取卵后4～6 h將卵丘結(jié)構(gòu)去除，選擇見到極體的MⅡ卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下注射；體外授精l6～18 h后觀察有無原核，40 h左右后觀察卵裂情況，并選擇可利用胚胎進(jìn)行冷凍。

3.復(fù)蘇周期：女方月經(jīng)規(guī)律者采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜；月經(jīng)異常者采用促排卵周期準(zhǔn)備內(nèi)膜：從月經(jīng)周期第3天予以補(bǔ)佳樂(江蘇恒瑞醫(yī)藥)口服，2 mg/次，bid，每隔3 d增加1 mg。于月經(jīng)周期第12天，陰超下監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，用孕激素轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜，為胚胎移植做準(zhǔn)備，F(xiàn)ET術(shù)后常規(guī)黃體支持。

4.臨床妊娠判斷：FET后14 d，檢測(cè)受試者尿和血清β-HCG水平，若β-HCG>10 U/L，則為生化妊娠；移植后28～30 d后行超聲檢查，若見孕囊(含宮外妊娠)則為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

本研究共納入667對(duì)不孕夫婦，最終獲得臨床妊娠334例，總?cè)焉锫蕿?0.07%(334/667)；流產(chǎn)數(shù)66例，總流產(chǎn)率為19.76%(66/334)。不同DFI水平組一般資料如男、女方年齡、精子濃度、精子活率、獲卵數(shù)、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度及移植胚胎數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但高DFI組的受精率顯著低于低DFI組(P<0.05)(表1、2)。

表1 男方患者一般資料的比較(-±s)

表2 女方患者一般資料的比較(-±s)

注：與低DFI組比較，*P<0.05

二、不同精子DFI水平對(duì)妊娠結(jié)局的影響

不同精子DFI的兩組比較，低DFI組的臨床妊娠率顯著高于高DFI組(54.21% vs. 42.11%)(P<0.05)，流產(chǎn)率則顯著低于高DFI組(16.81%vs. 27.08%)(P<0.05)(表3)。

表3 不同精子DFI水平對(duì)妊娠結(jié)局的影響(%)

注：與低DFI組比較，*P<0.05

三、低DFI組中不同受精方式(IVF/ICSI)對(duì)妊娠結(jié)局的影響

低DFI組中IVF組和ICSI組的臨床妊娠率分別為52.63%、58.62%，組間比較無顯著性差異(P>0.05)；IVF組和ICSI組的流產(chǎn)率分別為15.88%、19.12%，組間比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同受精方式對(duì)低DFI組妊娠結(jié)局的影響(%)

四、高DFI組中不同受精方式(IVF/ICSI)對(duì)妊娠結(jié)局的影響

高DFI組中IVF組和ICSI組的臨床妊娠率分別為33.33%、48.48%，ICSI組顯著高于IVF組(P<0.05)；且ICSI組的流產(chǎn)率顯著低于IVF組(40.63% vs. 20.31%)(P<0.05)(表5)。

表5 不同受精方式對(duì)高DFI組妊娠結(jié)局的影響(%)

注：與IVF組比較，*P<0.05

討 論

精子DNA損傷是多重因素協(xié)同作用的結(jié)果，主要包括：精子發(fā)生異常、氧化應(yīng)激損傷、精子異常凋亡。目前大家比較關(guān)注的問題是輔助生殖的妊娠結(jié)局是否受精子DNA 損傷的影響。有研究報(bào)道，在輔助生殖過程中，體外受精失敗、胚胎發(fā)育異常、胎兒出生缺陷以及后代高發(fā)病率等均與不同程度的精子DNA損傷相關(guān)[4]。因此重視精子DNA完整性的檢測(cè)及治療是十分有意義的。目前評(píng)價(jià)精子DNA完整性的主要指標(biāo)是精子DFI，關(guān)于其能否預(yù)測(cè)ART的妊娠結(jié)局，一直存在較大爭(zhēng)議。

關(guān)于精子DFI程度對(duì)精液常規(guī)分析的影響，各研究結(jié)論并不一致。有研究認(rèn)為精子DNA碎片率與精子密度、精子活率及精子正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)[5]；但也有研究表明傳統(tǒng)的精液參數(shù)如精液密度、運(yùn)動(dòng)性及正常形態(tài)率與DFI無顯著相關(guān)性[6]。關(guān)于不同研究中常規(guī)精液參數(shù)和DFI之間相關(guān)性的爭(zhēng)議可能歸因于[7]：(1)DNA完整性測(cè)試的方法不同，可影響DNA損傷的不同方面，并不總是能提供可比較的結(jié)果；(2)常規(guī)精液參數(shù)分析中應(yīng)用的方法學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)的可變性，可能會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；此外，各種指南如WHO 1999年或2010年手冊(cè)因研究而異，可能導(dǎo)致確定“正?！钡膮⒖枷拗苹煜?；(3)精液參數(shù)測(cè)試中的質(zhì)量控制方案不同及主觀性影響；(4)所研究的人口群體選擇標(biāo)準(zhǔn)缺乏統(tǒng)一性。本研究結(jié)論與后者[6]一致，可能與納入的研究對(duì)象或處理流程中存在上述因素有關(guān)。

另外，有關(guān)于精子DNA完整性的流行病學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，精子DFI程度與IVF成功率成負(fù)相關(guān)。本研究顯示低DFI組的受精率顯著優(yōu)于高DFI組(P<0.05)。正常情況下，卵母細(xì)胞具有修復(fù)輕微精子DNA損傷的能力，但是當(dāng)精子DNA損傷≥8%時(shí)這種修復(fù)機(jī)制便不再起作用，高水平精子DNA損傷仍可以阻礙卵母細(xì)胞激活，從而影響胚胎發(fā)育[8]。有學(xué)者認(rèn)為引起患者受孕率顯著下降的精子DFI閾值為>30%，Lewis等[9]研究也證實(shí)當(dāng)精子DFI>30%時(shí)，自然受孕和宮腔內(nèi)人工授精(IUI)助孕的成功率幾乎為零。且高水平的DFI會(huì)引起受精率降低、胚胎質(zhì)量下降，影響囊胚形成、引發(fā)胚胎停育等不良結(jié)局[10-11]，本研究與上述結(jié)論一致。本研究也顯示低DFI組的受精率、臨床妊娠率均顯著優(yōu)于高DFI組，且流產(chǎn)率顯著低于高DFI組(P均<0.05)，表明精子DNA損傷程度對(duì)受精能力及妊娠結(jié)局有重要影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)在低DFI組，常規(guī)IVF或ICSI受精后的臨床妊娠率、流產(chǎn)率并無顯著性差異(P>0.05)，與Chi等[12]的研究結(jié)論一致。但關(guān)于高DFI組的患者行ICSI還是IVF目前尚無統(tǒng)一定論。Anifandis等[13]研究表明，在精子DFI高水平組行IVF和ICSI助孕時(shí)，兩種方式的妊娠結(jié)局差異并不顯著(P>0.05)。但另有研究顯示，相比常規(guī)的IVF，ICSI助孕更能改善高DFI水平組患者的臨床妊娠結(jié)局，包括分娩率[14]和臨床妊娠率[14-17]。本研究結(jié)果顯示：高DFI組中ICSI組的臨床妊娠率顯著高于IVF組(P<0.05)，證實(shí)了精子DFI在較高水平時(shí)，采用ICSI助孕可獲得較高的臨床妊娠率。另外，本研究中接受ICSI助孕的患者中，高DFI、低DFI組的臨床妊娠率分別為48.48%(64/132)、58.62%(68/116)，二者比較差異并不顯著(P>0.05)，表明精子DNA損傷引起的妊娠率下降可通過ICSI得到改善。本研究結(jié)果還顯示高DFI組中IVF、ICSI的流產(chǎn)率分別為40.63%、20.31%，二者比較有顯著性差異(P<0.05)，這可能與ICSI助孕時(shí)大多選擇形態(tài)正常且運(yùn)動(dòng)較快的精子有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示精子DNA損傷會(huì)不同程度影響ART妊娠結(jié)局，因此降低精子DFI是十分必要的。精子DNA損傷大多來自于活性氧(ROS)對(duì)精子的破壞[18]，目前臨床上改善精液質(zhì)量的藥物以抗氧化劑為主，其中維生素E在治療男性不育中的價(jià)值得到廣泛認(rèn)可[19]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在飼料中添加濃度為12 g·kg-1·h-1的維生素E，可以顯著提高小鼠精液中相關(guān)酶的活性和精子DNA完整性[20]。李維宏等[21]在研究維生素E治療不明原因男性不育有效性的meta分析中推測(cè)出維生素E可能是通過降低精子DNA碎片比例來增加DNA完整性。因此精子DNA損傷水平較高者可先行藥物治療后再進(jìn)一步助孕治療，或許可以改善妊娠結(jié)局。另外關(guān)于精子DNA檢測(cè)的方法，目前主要有SCSA、彗星實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、PCR及基因芯片技術(shù)等檢測(cè)方法，但是關(guān)于這些檢測(cè)技術(shù)目前并無標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作方法及嚴(yán)格的質(zhì)量控制來保證精子DNA損傷檢測(cè)的準(zhǔn)確性。目前認(rèn)為SCSA是檢測(cè)精子DNA損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中采用了SCSA染色后再通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法，流式細(xì)胞儀能發(fā)現(xiàn)精液常規(guī)檢測(cè)中不能發(fā)現(xiàn)的信息，不僅具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，還能客觀、快速地通過對(duì)精子DNA質(zhì)量的分析來揭示精子發(fā)生及成熟過程中的病理變化過程，因此提高了本研究中精子DNA檢測(cè)水平的準(zhǔn)確性。

本研究雖然嚴(yán)格控制了研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)，排除了患有如子宮內(nèi)膜異位癥、PCOS等疾病的女性，一定程度上增加了研究結(jié)論的可靠性，但由于本研究是回顧性分析，可能在樣本選擇上具有偏倚性，并且研究資料樣本量較少，尤其是精子DFI較高者，從而對(duì)部分結(jié)論(如精子DNA對(duì)精液密度及活率的關(guān)系)產(chǎn)生了影響。另外關(guān)于精子DFI對(duì)ART妊娠結(jié)局的影響，各個(gè)研究由于納入對(duì)象、研究及檢測(cè)方法不同，結(jié)論尚存在較大差異。本研究與前述既往部分研究基本一致，但還需進(jìn)一步加大樣本量，規(guī)范精子DFI檢測(cè)方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行前瞻性研究，以進(jìn)一步證實(shí)精子DFI對(duì)妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)的可靠性與科學(xué)性。

綜上所述，精子DNA完整性對(duì)輔助生殖的妊娠結(jié)局有重要意義，精子DFI水平較高時(shí)選擇ICSI助孕可能更有利于妊娠結(jié)局，臨床工作中應(yīng)重視精子DNA完整性的檢測(cè)。關(guān)于高水平精子DFI患者行ICSI對(duì)妊娠結(jié)局的影響，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討，以期更好地指導(dǎo)臨床工作；另外，關(guān)于如何在行IVF或ICSI助孕前降低精子DNA損傷及其對(duì)后代的影響值得進(jìn)一步關(guān)注。