胡藍(lán)方，李艷梅，沈 甜，王 娟，任泓霖，韋宇脈，謝雨歆，閆 敏，朱 軍，余秀梅

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 611130）

攀枝花市位于中國西南川滇交界處，釩鈦磁鐵礦產(chǎn)資源極為豐富。釩鈦磁鐵礦中含有大量Fe、V、Ti，同時伴生有 Cr、Cu、Zn、Mn、Ni 等。長期開采導(dǎo)致礦區(qū)土壤重金屬污染嚴(yán)重，生態(tài)環(huán)境十分脆弱[1]。土壤重金屬污染可被植物吸收富集，通過食物鏈在動物和人體內(nèi)累積，對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。生物修復(fù)因具備操作簡單、成本低、無二次污染等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于重金屬污染土壤修復(fù)[2]。其中，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)主要利用根際微生物的促生作用提升植物生物量或通過氧化還原反應(yīng)等作用改變重金屬生物有效性來強(qiáng)化植物修復(fù)，已成為國內(nèi)外研究熱點[3]。

根瘤菌與豆科植物共生結(jié)瘤固氮作用可以補(bǔ)充植物氮營養(yǎng)、促進(jìn)植物生長、增加植物的抗病性和抗逆性，還可修復(fù)重金屬、多環(huán)芳烴等污染土壤[4]。據(jù)報道，根際接種根瘤菌使鷹嘴豆植株銅含量降低，但生物量顯著增加[5]。豆科草本植物紫花苜蓿（Medicago sativa）因具抗逆性強(qiáng)、耐瘠薄等特點，被認(rèn)為是應(yīng)用前景較好的土壤污染修復(fù)豆科植物[6]。紫花苜蓿已應(yīng)用于植物修復(fù)鉛鋅尾礦、鐵礦排土場等研究中，能顯著降低礦區(qū)土壤中 Cu、Zn、Cd、Pb 濃度[7-9]，但其應(yīng)用于釩鈦磁鐵尾礦土壤修復(fù)的相關(guān)研究尚無。

豆科喬木植物水黃皮-根瘤菌聯(lián)合技術(shù)在攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中表現(xiàn)出較好的修復(fù)效果，尤其對Fe、Ni 富集修復(fù)效果明顯[10]，但存在此喬木修復(fù)技術(shù)對空間利用不足的問題。對攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中苜蓿根瘤菌進(jìn)行捕獲分離及遺傳多樣性研究，并篩選出本土高效的共生固氮苜蓿根瘤菌，以為苜?！鼍?lián)合修復(fù)攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤污染提供可利用的根瘤菌資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 苜蓿根瘤菌的捕獲

采集攀枝花新九鄉(xiāng)的釩鈦磁鐵尾礦土壤，開展室內(nèi)盆栽試驗捕獲土著苜蓿根瘤菌，即：選擇飽滿的紫花苜蓿種子，先后用1‰ HgCl2和95%酒精進(jìn)行表面滅菌5 min，用無菌水清洗數(shù)次，再將其播種在裝有尾礦土壤的口徑20 cm 左右的花盆中，放置于光照室（25 ℃光照 17 h，17 ℃黑暗 7 h）中培養(yǎng)，并不定時地統(tǒng)一補(bǔ)充足夠的無菌水，3 個月后收獲紅潤飽滿的苜蓿根瘤。

1.2 苜蓿根瘤菌的分離與純化

對獲得的根瘤用乙醇和HgCl2進(jìn)行表面滅菌，搗碎，劃線于YMA 培養(yǎng)基（甘露醇1.0 g/L，酵母浸出粉 1.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，瓊脂粉 18 g/L，pH 值 7.0～7.2），置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢直至得到純菌，保種在YMA 斜面培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱中待用，并保存于30%甘油置于-80 ℃冰箱中備用[11]。

1.3 苜蓿根瘤菌總DNA的提取

將供試菌株接種于TY 液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨5 g/L，酵母浸出粉 3 g/L，CaCl2·2H2O 0.7 g/L）中，在28 ℃、150 r/min 搖床中培養(yǎng) 2～3 d，收集菌液于 1.5 mL EP 管中，采用試劑盒的方法提取根瘤菌總DNA，試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.4 根瘤菌16S rRNA基因的擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA 基因擴(kuò)增采用通用引物 27F 和1492R[12]，序列分別為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3' 和 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR 擴(kuò)增采用 30 μL 體系（mix 15 μL，27F 0.15 μL，1492R0.15μL，DNA1μL，ddH2O 13.7 μL），擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用含EB 的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并送至成都擎科公司測序，測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對，得到16S rRNA 基因的序列相似性及同源基因[15]，建立供試菌株的16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 持家基因atpD、rpoB 和glnII 基因擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析

對持家基因 atpD、rpoB 和 glnII 序列進(jìn)行擴(kuò)增[13]，atpD 基因擴(kuò)增采用引物 255F 和 782R，序列分別為5'-GCT SGG CCG CAT CMT SAA CGT C-3'和5'-CCG ACA CTT CMG AAC CNG CCT G-3'，PCR 擴(kuò)增采用 30 μL 體系（mix 15 μL，255F 0.15 μL，782R 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL）；擴(kuò)增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃7 min。rpoB 基因擴(kuò)增采用引物 454F和1364R，序列分別為5'-ATCGTCTCGCAGATG CACCG-3'和 5'-TCGATGTCGTCGATYTCGCC-3'，PCR 擴(kuò)增采用 30 μL 體系（mix 15 μL，454F 0.15 μL，1364R 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL），擴(kuò)增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。glnII 基因擴(kuò)增采用引物 12F和tsR，序列分別為5'-YAAGCTCGAGTACATYTGGCT-3' 和 5' -GAGCCGTTCCAGTGGTGTCG -3'，PCR 擴(kuò)增采用 30 μL 體系（mix 15 μL，12F 0.15 μL，tsR 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL），擴(kuò)增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對，獲得苜蓿根瘤菌的相近模式菌株持家基因序列，建立供試菌株的持家基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 根瘤菌回接與共生固氮效率測試

回接試驗采用Lenoards Jar 裝置[14]來種植苜蓿，稱取定量的蛭石裝入啤酒瓶中，用蒸餾水潤濕基質(zhì)，并在下方的塑料底瓶中加入750 mL 無氮營養(yǎng)液，上方用封口膜密封在1×105Pa 下滅菌30 min，冷卻后備用。挑選已經(jīng)表面滅菌和無菌條件下催好芽的種子種在裝置中，并在表面鋪上無菌干燥石英砂以防止雜菌進(jìn)入裝置中。待苜蓿長出土表1～3 cm左右接種根瘤菌菌液。將純化保種的根瘤菌接種到5 mL TY 液體培養(yǎng)基中，在150 r/min 28 ℃條件下?lián)u培2 d，向每個盆栽中接種3 mL 菌液（108/mL）。將裝置置于光照室（25 ℃光照17 h，17℃黑暗7 h）中進(jìn)行盆栽試驗，在種植期間不定時統(tǒng)一用無氮營養(yǎng)液（KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO40.2 g/L，F(xiàn)eEDTA 1 mg/L，CaSO4·2H2O 0.2 g/L，CaCO32 g/L，Trace 10 ml/L）進(jìn)行補(bǔ)充，并對其進(jìn)行根瘤菌有無的觀察。3 個月后收獲植株，將植株置于108 ℃烘箱中殺青 30 min，80 ℃烘干至恒重，用 H2SO4-H2O2對植物樣品進(jìn)行消煮，用凱氏定氮法測定其總氮含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

供試菌株的16S rRNA 基因與參比菌株序列用MEGA7.0 軟件采用最大似然法[15]（maximum likelihood）進(jìn)行分析，構(gòu)建供試菌株的16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹。供試菌株的持家基因與參比菌株序列用MEGA7.0 對 atpD、rpoB、glnII 基因分別進(jìn)行比對，以最小長度為標(biāo)準(zhǔn)剪齊，將3 個序列拼接在一起采用最大似然法對根瘤菌的持家基因構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。

根瘤菌回接苜蓿的共生固氮效率用Microsoft Excel 2013 進(jìn)行處理，試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用P＜0.05 作為顯著差異判斷依據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿根瘤菌的純化分離

對根瘤內(nèi)的根瘤菌進(jìn)行分離純化，選擇菌落形態(tài)呈黏液狀、邊緣整齊、透明、半透明或不透明、顏色為乳白色的根瘤菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察為革蘭氏陰性桿狀菌。共得到46 株菌株。

2.2 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

對純化分離出46 株菌的16S rRNA 基因進(jìn)行測序，基因序列在NCBI 中BLAST 比對分析發(fā)現(xiàn)，9株菌為根瘤菌，編號為MX1-MX9。9 株菌分別與中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的16S rRNA 基因相似性達(dá)98%～100%。采用MEGA7.0 的最大似然法對9 株菌和24 株根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明這9 株菌分別屬于中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬。其中菌株MX1和MX4 與參比菌株S.meliloti IAM 12611T聚在一個分支，序列相似性達(dá)99%，屬于中華根瘤菌屬。MX2 和MX5 距離較近，均與參比菌株R.radiobacter IAM 12048T聚在一個分支，序列相似性達(dá)99%；MX8 單獨處于一個小分支上，與參比菌株R.leguminosarum ATCC 10004T親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)100%；MX2、MX5 和 MX8 均屬于根瘤菌屬。菌株MX3 和MX9 處于同一個小分支，與參比菌株B.cytisi CTAW11T相似性達(dá) 99%，MX6 與參比菌株 B.pachyrhizi PAC 48T相似性達(dá) 99%，MX7 與參比菌株B.daqingense CCBAU 15774T的相似性達(dá) 99%；MX3、MX6、MX7 和MX9 屬于慢生根瘤菌屬。

2.3 持家基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 苜蓿根瘤菌16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA genes for the alfalfa nodulating rhizobia

對 9 株菌的持家基因（atpD、rpoB 和 glnII）進(jìn)行測序，用MEGA7.0 的最大似然法對9 株菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對，構(gòu)建持家基因3 個點位（atpD、rpoB和glnII）聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明9 個菌株在屬種的分類結(jié)果與16S rRNA 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果一致。中華根瘤菌屬M(fèi)X1 和MX4 與參比菌株S.meliloti IAM 12611T距離最近；根瘤菌屬中MX2與MX5 與參比菌株R.radiobacter HAMBI 1814T距離最近，MX8 與參比菌株R.leguminosarum ATCC 10004T距離最近；慢生根瘤菌屬中MX3 和MX9 與參比菌株B.cytisi LMG 25866T距離最近，MX6 與參比菌株B.pachyrhizi PAC 48T距離最近，MX7 與參比菌株B.daqingense CCBAU 15774T距離最近。因此，根據(jù)種水平內(nèi)16S rRNA 基因同源性應(yīng)大于或等于97%的標(biāo)準(zhǔn)[16]，并結(jié)合持家基因的系統(tǒng)進(jìn)化地位，將 MX1 和 MX4 鑒定為 S.meliloti，MX2 和 MX5 鑒定為R.radiobacter，MX8 鑒定為R.leguminosarum，MX3 和 MX9 鑒定為 B.cytisi，MX6 鑒定為 B.pachyrhizi，MX7 鑒定為 B.daqingense。

圖2 苜蓿根瘤菌持家基因（atpD-rpoB-glnII）的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of housekeeping genes （atpD-rpoB-glnII ） for the rhizobia nodulating alfalfa

2.4 根瘤菌回接試驗分析

為篩選出高效固氮根瘤菌，將捕獲到的苜蓿根瘤菌回接于苜蓿根際中，結(jié)果表明9 株菌都表現(xiàn)出對苜蓿的促生作用，不同菌株對苜蓿的影響差異較大（表1）。對苜蓿株高影響最大的菌株依次為 MX9、MX3、MX1，株高分別比對照高 27.0%、29.9%、33.9%，對苜蓿根長影響最大的菌株依次為MX1、MX9、MX7，分別比對照高 61.7%、89.4%、93.9%；對生物量影響最大的菌株依次為MX6、MX9、MX7，分別比對照高89.2%、103.4%、139.0%，其中MX7對苜蓿生物量的增加效果和添加N 元素的對照組效果相近。9 株菌和未接種根瘤菌的對照組中苜蓿均有結(jié)瘤，苜蓿根瘤菌共生體系與不添加N 元素的對照相比，含氮量有明顯提高。對含氮量提高最為顯著的 3 株菌分別為 MX9、MX7、MX8，較對照組分別提高182.4%、205.9%、270.6%。其中添加苜蓿根瘤菌MX8 的處理含氮量提高效果最為顯著，達(dá)到了6.3 g/kg，較添加N 元素的對照組相比，差距最小。結(jié)合苜蓿的生長狀況和氮含量篩選出苜蓿促生效果好的3 株根瘤菌MX1、MX7 和MX8。

表1 苜蓿生長指標(biāo)及含氮量Table 1 The growth indexes and nitrogen content of alfalfa

3 討論與結(jié)論

重金屬毒性和土壤肥力差是限制植物在重金屬污染土壤中生長的主要因子，因此礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)的關(guān)鍵在于增強(qiáng)植物的耐受性和提高土壤肥力[17]。苜蓿是一種在我國廣泛種植的優(yōu)質(zhì)豆科牧草，它與根瘤菌形成的共生體系能有效固氮，提高苜蓿的含氮量和抗逆性[18]，其在復(fù)合重金屬污染土壤中有較好的修復(fù)效果，對土壤中重金屬具有富集潛力[19]。

攀枝花礦區(qū)土壤含有多種金屬元素，但根瘤菌資源豐富。據(jù)報道，攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中有與豆科植物水黃皮、大豆、豇豆共生結(jié)瘤固氮的根瘤菌屬、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、慢生根瘤菌屬等[20-21]。本研究通過盆栽捕獲試驗從攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中分離到9 株苜蓿根瘤菌，利用16S rRNA 和持家基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析確定根瘤菌的分類地位。16S rRNA 基因保守性較高，其系統(tǒng)發(fā)育樹離散程度較小，一般只能確定到屬水平[22]；持家基因與16S rRNA 基因相比具有更高的序列差異性，同時具有作為進(jìn)化信號的相對保守性，因此持家基因的多序列位點分析常用于確定種群關(guān)系[23]。本研究中9 株根瘤菌的16S rRNA 基因和持家基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析中分類結(jié)果基本一致，通過將種水平內(nèi)菌株的16S rRNA 基因相似性等于或大于97%作為標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合相對保守的持家基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，明確了攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中的苜蓿根瘤菌系統(tǒng)進(jìn)化地位。因此，將其分別鑒定為根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和中華根瘤菌屬，說明攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中存在豐富的豆科植物共生根瘤菌資源，其遺傳性豐富多樣。

苜蓿共生根瘤菌主要集中在中華根瘤菌屬，也有少數(shù)環(huán)境中能分離到與苜蓿共生的根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬[24-26]。本研究從攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中捕獲分離到與苜蓿共生的根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和中華根瘤菌屬，說明攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中含有豐富的苜蓿共生根瘤菌，也說明根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系會因地域土壤環(huán)境差異而不同[27]。雖然苜蓿根瘤中能分離出根瘤菌R.radiobacter和R.leguminosarum，但其均不能與苜蓿共生結(jié)瘤[28-29]，說明根瘤中存在非共生根瘤菌，同時也說明根瘤菌與苜蓿共生具有較高的選擇性[30]。本研究從攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中分離出的9 株根瘤菌均能與苜蓿共生結(jié)瘤固氮且表現(xiàn)出較強(qiáng)的促生能力，說明釩鈦磁鐵礦區(qū)土壤中的土著根瘤菌具有較好的共生特性[31]，釩鈦磁鐵尾礦土壤中豐富多樣的土著苜蓿共生固氮根瘤菌，可使強(qiáng)化礦區(qū)重金屬污染土壤的苜蓿修復(fù)效果成為可能。

根瘤菌與豆科植物共生固氮影響植株氮含量、干重、生長狀況等多項指標(biāo)[32]。本研究篩選獲得的高效共生固氮根瘤菌MX1、MX7 和MX8 也顯著影響了苜蓿的氮含量、株高、根長及生物量。其中，R.leguminosarum MX8 使苜蓿植株氮含量達(dá)到了6.3 g/kg，較不接菌且不施氮肥的對照植株提高了3 倍，而僅比不接菌且施用氮肥的苜蓿植株低6%，說明MX8能與苜蓿高效共生固氮，其固氮效率與施氮肥接近。雖然S.meliloti MX1 并不能顯著提高植株的氮含量，但能顯著促進(jìn)苜蓿的生長，這可能是由于MX1 與苜蓿草共生過程中產(chǎn)生的其他生長因子促進(jìn)了苜蓿植株的生長；B.daqingense MX7 不僅可以顯著提高植株氮含量（其氮含量是不接菌且不施氮肥的3 倍），而且能使植株的株高、根長、生物量顯著增加；這說明不同的苜蓿根瘤菌表現(xiàn)出不同的共生固氮效率和促生能力。本研究篩選獲得的苜蓿共生根瘤菌為進(jìn)一步構(gòu)建苜蓿-根瘤菌聯(lián)合修復(fù)釩鈦磁鐵礦區(qū)土壤的技術(shù)體系提供可利用的根瘤菌資源。

攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中的苜蓿共生根瘤菌豐富多樣，主要包括中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬，分離篩選出的S.meliloti MX1、B.daqingense MX7 和R.leguminosarum MX8 對苜蓿表現(xiàn)出較強(qiáng)的促生能力，其能顯著提高苜蓿的氮含量、株高、根長和生物量，為進(jìn)一步應(yīng)用于釩鈦磁鐵礦尾礦土壤的苜蓿-根瘤菌聯(lián)合修復(fù)提供可利用的菌株資源，但苜蓿與根瘤菌聯(lián)合修復(fù)釩鈦磁鐵尾礦土壤效率還有待進(jìn)一步研究。