李 哲，玄 靜，趙振華，馬 婷，張永清*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2.山東省高校中藥資源學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250355）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥未開放花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，用于治療癰腫疔瘡、熱毒血痢、溫病發(fā)熱等病癥[1-2]，屬于大宗常用中藥材。主要含有綠原酸、黃酮、環(huán)烯醚萜等成分，其中綠原酸與木犀草苷為其質(zhì)量指標(biāo)成分[3]?，F(xiàn)代研究結(jié)果顯示[4-5]，金銀花藥理活性獨(dú)特，在抗病毒作用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，其毒副作用小，為溫病治療之要藥?！叭A金6號(hào)”是本課題組選育出的金銀花新品種，具有活性成分含量高、采收成本低等優(yōu)點(diǎn)，推廣應(yīng)用前景廣闊[6]，但其藥理藥效尚待深入研究。H9-AIV 屬于致病性禽流感病毒，可引起家禽流行性疫病，甚至還可感染人、豬等哺乳動(dòng)物[7]。為探討“華金6 號(hào)”新品種抗病毒活性，本試驗(yàn)以金銀花傳統(tǒng)品種“大毛花”為對(duì)照，采用雞胚尿囊腔接種及血凝（HA）試驗(yàn)，檢測(cè)了二者體外抗H9-AIV 活性。本研究擬證實(shí)“華金6 號(hào)”金銀花抗病毒活性，在此基礎(chǔ)上，更好地推進(jìn)該品種的推廣種植，促進(jìn)臨床抗病毒藥物的合理用藥。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥材：“華金6 號(hào)”新品種與“大毛花”傳統(tǒng)品種藥材均于2017年5 月份采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，曬干，備用。原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定， 確認(rèn)物種均為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.。

主要試劑：利巴韋林注射液（1 mL ∶0.1 g，批號(hào)：1701122611）；綠原酸對(duì)照品(購自中國食品藥品檢定研究所批號(hào)：110753-201716）。

病毒：H9 亞型禽流感病毒 S2 株（H9-AIVs2），由山東農(nóng)科院家禽所禽病研究室提供。

雞胚：9～11 日齡 SPF 雞胚， 由山東昊泰特種動(dòng)物繁育有限公司提供。

1%雞紅細(xì)胞懸液：采集健康雞血液，4%檸檬酸鈉抗凝（抗凝劑∶血液=1∶4），加入無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS），2 000 r/min 離心 5 min，洗滌 3 次，棄上清液。取沉淀紅細(xì)胞，用PBS 緩沖液稀釋配成1%雞細(xì)胞懸液，4 ℃冷藏，備用。

主要儀器：生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2FD 型）；孵化機(jī)（北京海江孵化設(shè)備有限公司）；液相色譜儀（島津LC-20AD）；全波長掃描色譜工作站；低溫高速離心機(jī)（德國Thermo）；高壓蒸汽滅菌器（新華醫(yī)療設(shè)備有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器；PH 儀（METTLER TOLEDO）；96孔V 型血凝板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取物制備與綠原酸含量測(cè)定

1.2.1.1 提取物制備

經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)， 采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝為：稱取金銀花藥材50 g，加15倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，9 號(hào)藥典篩濾過，取藥渣再加10 倍量水煎煮45 min，過濾，合并藥液。濃縮至50 mL，相當(dāng)于每毫升藥液含1 g 原藥材。濃縮液高壓滅菌（115 ℃，45 min）后置 4 ℃冷藏，備用。體外試驗(yàn)時(shí)，取濃縮液置微量離心管中，用低溫高速離心機(jī)10 000 r/min 離心10 min，取上清液。

1.2.1.2 綠原酸含量測(cè)定[8-9]

對(duì)照品溶液制備：精密稱取適量綠原酸對(duì)照品，用50%甲醇配制成42 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備：精密量取藥材提取液2 mL于50 mL 棕色容量瓶，用50%甲醇定容，搖勻，檢測(cè)時(shí)用0.45 μm 微孔濾膜濾過。

色譜條件：色譜柱：C18 反相色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（13∶87）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；波長：327 nm。

在上述色譜條件下檢測(cè)，得到對(duì)照品及供試品溶液峰面積，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算綠原酸含量。

1.2.2 H9-AIV 增殖及效價(jià)測(cè)定

將H9-AIV 懸液與滅菌PBS 緩沖液以1∶1 000比例進(jìn)行稀釋處理， 提前將8 枚10 日齡的雞胚做好接種點(diǎn)標(biāo)記，采用尿囊腔接種法[10-13]進(jìn)行接種。將接種后的雞胚置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)96 h， 每12 h 照胚 1 次，棄去 24 h 內(nèi)死亡雞胚，收集 24～96 h 雞胚尿囊液，測(cè)其血凝（HA）滴度并選取血凝滴度大于8的H9-AIV 作為試驗(yàn)病毒[14]。

1.2.3 H9-AIV 在雞胚上半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定

用滅菌PBS 緩沖液將新鮮H9-AIV 作2 倍倍比稀釋（10-1～10-12），提前將雞胚做好接種點(diǎn)標(biāo)記，每個(gè)稀釋度的H9-AIV 病毒液分別接種于5 枚9～10日齡的 SPF 雞胚尿囊腔內(nèi)，0.1 mL/胚， 并設(shè) PBS 對(duì)照組。接種完成后，將雞胚置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每12 h 照胚1 次，棄掉24 h 內(nèi)的死亡雞胚，取培養(yǎng)24～96 h 的雞胚置 4 ℃保存。收取尿囊液做 HA 試驗(yàn)，將血凝板做好標(biāo)記，每胚分別取0.1 mL 尿囊液依次加在血凝板上， 然后分別加入新鮮的1%雞紅細(xì)胞懸液0.1 mL，輕輕震搖，放置30 min 后觀察結(jié)果，按 Reed Muench 法[15]計(jì)算。

1.2.4 最大不凝血濃度測(cè)定

取“華金6 號(hào)”新品種、“大毛花”傳統(tǒng)品種金銀花提取原液進(jìn)行離心處理，取上清液用pH 值為7.4的PBS 緩沖液2 倍倍比稀釋10 個(gè)濃度， 分別測(cè)定每個(gè)稀釋度溶液的血凝效價(jià)，同時(shí)設(shè)PBS 對(duì)照和病毒組對(duì)照。

1.2.5 對(duì)雞胚最大無毒濃度（TDO）測(cè)定

取“華金6 號(hào)”新品種與“大毛花”傳統(tǒng)品種金銀花提取原液作離心處理（10 000 r/min，10 min），分別取其上清液用滅菌PBS 緩沖液作兩倍系列稀釋（2-1～2-8），每個(gè)稀釋度分別取 0.2 mL 接種在預(yù)先標(biāo)記好的9～10 日齡SPF 雞胚上，6 枚雞胚為一個(gè)濃度組，并設(shè)PBS 對(duì)照。將接種好的雞胚置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)96 h， 每12 h 觀察并記錄雞胚的存活情況，棄掉24 h 內(nèi)的死亡雞胚。

1.2.6 “華金6 號(hào)”新品種金銀花、“大毛花”金銀花體外抗H9-AIV 感染實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 體外直接抑制試驗(yàn)

根據(jù)最大不凝血濃度，用PBS 緩沖液將“華金6號(hào)”新品種、“大毛花”傳統(tǒng)品種金銀花提取液分別稀釋成含生藥 31.25、15.625、7.812 5 mg/mL 3 個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)4 組平行對(duì)照，每組分別加入等體積量100EID50 的H9-AIV，搖勻，將試管置37 ℃中和 1、4、8、16、24、48 h，分別測(cè)定不同時(shí)間、不同稀釋度的HA 效價(jià)，同時(shí)設(shè)PBS 緩沖液對(duì)照組與病毒對(duì)照組[16]。試驗(yàn)結(jié)果見表 1。

1.2.6.2 中和試驗(yàn)

將藥物提取原液從TDO 起以2 倍比稀釋成125、62.5、31.25 mg/mL 3 個(gè)濃度， 各個(gè)濃度藥液分別與等體積100EID50 的H9-AIV 懸液于37 ℃作用2 h。將中和液對(duì)提前做好標(biāo)記的SPF 雞胚進(jìn)行尿囊腔接種， 每個(gè)稀釋度分別接種6 枚SPF 雞胚，0.2 mL/胚，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h，取出雞胚置-20 ℃放置2 h，收集雞胚尿囊液，分別測(cè)定其血凝效價(jià)[17]。同時(shí)設(shè)利巴韋林對(duì)照組、病毒對(duì)照組及PBS 緩沖液空白對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 體外直接抑制試驗(yàn)Table 1 Direct inhibition test in vitro

表2 中和試驗(yàn)Table 2 Neutralization test

1.2.6.3 預(yù)防試驗(yàn)

將藥物提取原液從TDO 起以2 倍比稀釋成125、62.5、31.25 mg/mL 3 個(gè)濃度， 各個(gè)濃度藥液分別以每胚0.1 mL 的量接種6 枚雞胚， 置37 ℃溫箱孵育，并設(shè)利巴韋林對(duì)照組及PBS 空白對(duì)照組。溫箱孵育 2 h 后， 用 0.1 mL 的 100EID50 的 H9-AIV懸液對(duì)每枚雞胚分別進(jìn)行接種， 于37 ℃的溫箱孵育。48 h 后，從溫箱內(nèi)取出全部雞胚置-20 ℃放置2 h，分別抽取雞胚尿囊液，做HA 試驗(yàn)，測(cè)定血凝滴度。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 預(yù)防試驗(yàn)Table 3 Prevention trials

1.2.6.4 治療試驗(yàn)

用0.1 mL 的100EID50 病毒懸液分別接種雞胚，置37 ℃下孵育2 h，然后用與預(yù)防試驗(yàn)同樣濃度的藥物進(jìn)行雞胚接種， 每個(gè)濃度組接種6 枚雞胚，設(shè)病毒、利巴韋林及PBS 緩沖液對(duì)照組，置37 ℃溫箱孵育48 h，取出雞胚于-20 ℃放置2 h，分別抽取雞胚尿囊液，做HA 試驗(yàn)，測(cè)定血凝滴度[12]。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 治療試驗(yàn)Table 4 Treatment trials

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定結(jié)果

在綠原酸對(duì)照品及金銀花提取物樣品色譜中，記錄相同保留時(shí)間下的峰高，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中綠原酸含量。經(jīng)計(jì)算得“華金6 號(hào)”新品種金銀花提取物樣品中綠原酸含量為0.925 5%，“大毛花” 金銀花提取物樣品中綠原酸含量為0.914 0%（見圖 1～圖 3）。

2.2 H9-AIV在雞胚上半數(shù)感染量（EID50）

試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得：EID50 為 10-8，試驗(yàn)用100EID50。

2.3 最大不凝血濃度

試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得：“華金6 號(hào)”新品種與“大毛花”傳統(tǒng)品種金銀花提取物不引起血凝的最大濃度為62.5、31.25 mg/mL。

2.4 對(duì)雞胚最大無毒濃度（TDO）

試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得：“華金6 號(hào)”花蕾提取物的TDO為125 mg/mL，“大毛花” 金銀花提取物的TDO 為125 mg/mL，利巴韋林注射液的TDO 為50 mg/mL。

2.5 兩種金銀花體外抗H9-AIV作用

“華金6 號(hào)”新品種金銀花與“大毛花”金銀花體外直接抑制H9-AIV 作用較強(qiáng)，與病毒對(duì)照組具有顯著差異性（P＜0.05），“華金 6 號(hào)”金銀花略優(yōu)于“大毛花”金銀花，且二者抗H9-AIV 作用在24 h 時(shí)達(dá)到最佳。

藥物與病毒體外先中和再接種時(shí)，兩種金銀花均表現(xiàn)為高濃度抑制效果好， 低濃度抑制效果差，二者抑制作用相當(dāng)（P＞0.05），高濃度藥物對(duì)病毒的抑制作用明顯高于利巴韋林組；“華金6 號(hào)”新品種金銀花應(yīng)用于雞胚接種試驗(yàn)，在預(yù)防與治療H9-AIV方面略高于“大毛花”金銀花（P＞0.05），但二者作用效果均低于利巴韋林對(duì)照組（P＞0.05） 。

病毒對(duì)照組雞胚在24 h 全部死亡，其他組雞胚在96 h 后全部死亡，但“華金6 號(hào)”新品種金銀花、“大毛花”金銀花、利巴韋林陽性對(duì)照組在48 h 時(shí)仍能保證雞胚有較高的存活率。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)選用“華金6 號(hào)”新品種金銀花水提液、“大毛花”金銀花水提液對(duì)H9-AIV 進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)研究。結(jié)果證明，兩種金銀花對(duì)H9-AIV 均表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外直接抑制作用， 且新品種略優(yōu)于“大毛花”金銀花。在用雞胚尿囊腔接種試驗(yàn)測(cè)其抗病毒作用時(shí)，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示其療效較弱且在96 h 時(shí)雞胚全部死亡，但相比在24 h 時(shí)病毒對(duì)照組全部死亡，金銀花組在48 h 時(shí)仍顯示較高的存活率，存活時(shí)間明顯高于病毒對(duì)照組。通過對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行分析，“華金6 號(hào)”新品種金銀花與“大毛花”金銀花具有抗H9-AIV 作用且“華金6 號(hào)”新品種作用較好。當(dāng)下，傳統(tǒng)金銀花面臨采收時(shí)間集中，人工采收成本高等問題，而本課題組定向培育的“華金6 號(hào)”新品種最大的特點(diǎn)是花蕾開放集中，產(chǎn)量高?！叭A金6號(hào)”大白期花蕾持續(xù)時(shí)間長達(dá)15 d，在很大程度上延長了采收期，提高了采收效率。王玲娜等[18]研究結(jié)果顯示“華金6 號(hào)”金銀花中的綠原酸和木犀草苷的含量在花蕾生長發(fā)育期內(nèi)比2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定含量分別提高了50.9%、168.0%，其應(yīng)用前景十分廣闊。

圖1 綠原酸對(duì)照品HPLC 圖譜Figure 1 HPLC spectrum of chlorogenic acid reference substance

圖2 “華金6 號(hào)”新品種金銀花樣品HPLC 圖譜Figure 2 HPLC spectrum of Lonicerae japonicae Flos new variety ‘Hua jin 6’

圖3 “大毛花”金銀花樣品HPLC 圖譜Figure 3 HPLC spectrum of Lonicerae japonicae Flos ‘Da mao hua’

應(yīng)用雞胚接種試驗(yàn)測(cè)得金銀花組相比病毒對(duì)照組48 h 后存活率高，但最終血凝試驗(yàn)所得血凝效價(jià)較高，原因可能在于雞胚內(nèi)環(huán)境與病毒在機(jī)體增殖環(huán)境相符，當(dāng)藥物與病毒在雞胚內(nèi)充分反應(yīng)的同時(shí)，病毒一直處于不斷的增殖中，而雞胚試驗(yàn)不能保證持續(xù)用藥，因此試驗(yàn)最終測(cè)得血凝結(jié)果是一次用藥對(duì)不斷增殖的病毒的作用。雞胚試驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)便，較CPE 法更加符合機(jī)體內(nèi)環(huán)境，適用于抗病毒藥物的體外篩選比較[19-20]，因此該研究應(yīng)用雞胚試驗(yàn)對(duì)兩種金銀花體外抗病毒作用進(jìn)行比較，結(jié)果得“華金6 號(hào)”新品種金銀花的抗病毒作用可達(dá)“大毛花”金銀花作用，綜合其采收期較長的優(yōu)勢(shì)，可為其推廣種植提供一定的依據(jù)。

近年來，抗病毒藥物的使用多集中在化學(xué)藥物上，其作用效率較高，但其對(duì)機(jī)體的副作用也日益突出，嚴(yán)重影響機(jī)體健康。我國中藥資源豐富，且其具備很多化學(xué)藥物沒有的優(yōu)點(diǎn)，因此，抗病毒中藥日益成為研究熱點(diǎn)，基于眾多學(xué)者大量的研究工作，大青葉、金銀花、黃芩、羌活等中藥已被證明具有一定的抗病毒作用[21-22]，且大多抗病毒中藥具有廣譜性、袪邪不傷正、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[23]。金銀花提取液作為天然抗病毒中藥，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其研究日益深入，研究表明綠原酸、木犀草苷、咖啡酸為金銀花抗病毒的主要活性成分[24-25]，另有研究通過體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)表明金銀花中的多糖成分可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力來發(fā)揮一定的抗病毒作用[26]。由于不同中藥在復(fù)雜的機(jī)體內(nèi)環(huán)境中作用機(jī)制亦不相同[27-28]，抗病毒中藥作用機(jī)理也有差異，研究發(fā)現(xiàn)中藥抗病毒作用與阻斷病毒蛋白質(zhì)復(fù)制、抑制病毒吸附、解熱抗炎、提高機(jī)體免疫力等多種藥理活性有關(guān)[29]，為深入了解“華金6 號(hào)”新品種金銀花抗病毒機(jī)制及其主要藥效成分，需從其分子作用機(jī)制等方面進(jìn)一步研究。

“華金6 號(hào)”新品種金銀花具有明顯的抗病毒活性，且與平邑地產(chǎn)“大毛花”品種比較，其抗病毒效果略高。綜合其活性成分含量高、采收期長、采收成本低等優(yōu)點(diǎn)， 可更好地推進(jìn)該品種的推廣種植，促進(jìn)臨床抗病毒藥物的合理用藥。