陳瀟瀟，羅紅艷，顧真琪，陳世品，曹光球，曹世江*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002）

油茶（Camellia oleifera Abel.）是中國(guó)南方重要的木本油料經(jīng)濟(jì)樹(shù)種之一，廣泛分布于長(zhǎng)江流域以南的大部分地區(qū)，與油橄欖（Olea europaea.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）、椰子（Cocos nucifera L.）并稱為世界四大木本油料植物[1-2]中國(guó)的油茶栽培和利用歷史長(zhǎng)達(dá)2 000 多年，油茶林栽培面積約為300 萬(wàn) hm2，油茶籽油年產(chǎn)量約為26 萬(wàn)t，產(chǎn)值高達(dá)110 億元[2]。此外，油茶還可用于開(kāi)發(fā)生物質(zhì)能源，對(duì)優(yōu)化中國(guó)能源結(jié)構(gòu)，減少對(duì)化石燃料的依賴，保障國(guó)家能源安全具有重大意義[3]。

茶油中包含多種不飽和脂肪酸，其中最主要的兩種不飽和脂肪酸油酸和亞油酸的總含量高達(dá)90%以上。亞油酸為多不飽和脂肪酸，是人體不可缺少而自身又不能合成的必需脂肪酸[4-5]。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)上講，油酸和亞油酸都能降低血清膽固醇，但因?yàn)橛退岜葋営退嵘僖粋€(gè)雙鍵，使油酸比亞油酸具有更高的抗氧化性，因此在提高油酸含量的同時(shí)亞油酸的含量也得以提升，這對(duì)茶油質(zhì)量的提高具有重大意義[6-7]。醫(yī)學(xué)研究表明，亞油酸還是胎兒神經(jīng)發(fā)育中十分重要的物質(zhì)，具有抑制膽固醇合成、調(diào)節(jié)血壓和抗氧化的作用，還可以有效地預(yù)防和治療冠心病、高血壓等心血管疾病[8-9]。故而茶油油質(zhì)極好，經(jīng)常食用又有預(yù)防心血管硬化美容養(yǎng)顏、降血壓降血脂、延年益壽等功效[10]。

FAD2（fatty acid desaturase 2）即脂肪酸去飽和酶 2，最初是從擬南芥（Arabidopsis thaliana）[11]中克隆出來(lái)，后來(lái)也陸續(xù)從大豆（Glycine max）[12]、花生（Arachis hypogaea）[13-14]、油桐（Vernicia fordii）[15]等油料植物中克隆到。在油茶果實(shí)發(fā)育的過(guò)程中，F(xiàn)AD2是控制油酸生成亞油酸的關(guān)鍵基因，其主要功能是在油酸的第12 和13 位碳原子之間形成雙鍵，生成亞油酸[16]因此CoFAD2-1 在一定程度上決定了茶油中油酸與亞油酸的比例，從而能夠改善茶油的品質(zhì)油茶閩48 是福建廣泛種植的高產(chǎn)品種，其種仁的含油率高達(dá)48.70%，遠(yuǎn)大于一些油料作物的含油率。本論文以該栽培品種為試驗(yàn)材料進(jìn)行CoFAD2-1 基因的克隆，分析其結(jié)構(gòu)和生物功能，該研究為改善茶油品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)具有較重要的實(shí)踐意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用2015年9 月中旬采自于福建省福州市閩侯縣桐口林場(chǎng)的福建油茶優(yōu)良品種閩48 的發(fā)育中期未成熟胚，閩48 當(dāng)年生嫩葉、根、莖，于2016年4 月中旬采自于福建農(nóng)林大學(xué)南門(mén)妙峰山試驗(yàn)田，采集后用錫箔紙包裹分裝于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。煙草瞬時(shí)表達(dá)所用煙草為生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)害的6～7 周本氏煙草。

1.2 油茶4種組織中總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

從4 種組織中運(yùn)用CTAB 法提取總RNA，利用TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行第一條鏈cDNA 的合成，并將濃度一致調(diào)為200 ng/μL。

1.3 基因的擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通過(guò)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的油茶FAD2 基因編碼區(qū)序列結(jié)合GATEWAY 系統(tǒng)運(yùn)用DNAMAN 6.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物QFAD2-Fw，QFAD2-Rv，并遞交上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件如下，采用 50 μL 體系：cDNA 1 μL，10×Pfu Buffer 5 μL，引物 pD207 FAD2-1 F（10 μM）1 μL，引物 pD207 FAD2-1 R（10 μM）1 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）4 μL，pfu DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 加至50 μL。94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min30 s，共 30 個(gè)循環(huán)，之后 72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器為L(zhǎng)ightCycler?Nano，擴(kuò)增試劑為 2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，采用熒光染料 SYBR Green I，參考油茶EF1α 基因作為內(nèi)參基因[17]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)體系見(jiàn)表2。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因PCR 擴(kuò)增的 Ct值，采用 2-△△Ct法[18]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化后送到鉑尚生物工程有限公司測(cè)序，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。運(yùn)用軟件Protparam 分析CoFAD2-1 蛋白的氨基酸數(shù)目、半衰期等理化性質(zhì)（http：//web.expasy.org/protparam/）；運(yùn)用 Psort 進(jìn)行 CoFAD2-1 蛋白結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析（https：//psort.hgc.jp/）；運(yùn)用Scratch Protein Predictor 進(jìn)行 CoFAD2-1 蛋白可溶性和二硫鍵預(yù)測(cè)分析（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）；運(yùn)用MEGA 6.0.5 進(jìn)行聚類分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；運(yùn)用Vector NTI 11.5 進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.5 CoFAD2-1蛋白的亞細(xì)胞定位

將 PCR 產(chǎn)物切膠回收，通過(guò) BP 反應(yīng)將CoFAD2-1 基因轉(zhuǎn)入 pDNOR207 載體中。BP 產(chǎn)物轉(zhuǎn)DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)慶大霉素（50 mg/L）篩選后挑取3 個(gè)單克隆搖菌并進(jìn)行菌落PCR 檢驗(yàn)，結(jié)果表明1、2、3 均為陽(yáng)性克隆，且大小合適，提取質(zhì)粒作為入門(mén)載體。通過(guò)LR 反應(yīng)將CoFAD2-1 基因克隆到植物表達(dá)載體pGWB505 上，并將LR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)壯觀霉素篩選單克隆進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，陽(yáng)性菌落搖菌并提取質(zhì)粒作為表達(dá)載體。將陽(yáng)性菌落運(yùn)用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，PCR 鑒定陽(yáng)性菌落。接菌至含對(duì)應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。制備農(nóng)桿菌懸浮液，調(diào)整菌液OD600 至1.0，在溫室下放置2 h，用1 mL 注射器在煙草葉片背面將菌液緩慢滲透注射到葉片組織間隙中，25 ℃條件下培養(yǎng)36 h 后在熒光顯微鏡下觀察，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)mcherry marker 標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[19]。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

2 結(jié)果與分析

2.1 CoFAD2-1基因克隆

從油茶胚中提取RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，電泳得到特異性條帶（圖1），約為1 000 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，隨后將PCR 產(chǎn)物送至鉑尚生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 CoFAD2-1基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CoFAD2-1 蛋白基本理化性質(zhì)分析

運(yùn)用Protparam 軟件推測(cè)CoFAD2-1 蛋白的基本理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白相對(duì)分子量為44.34 kDa，理論IP 值為8.07。負(fù)電荷殘基數(shù)為30，正電荷殘基數(shù)32。理論推導(dǎo)半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為39.28，屬于穩(wěn)定蛋白。理論上脂肪系數(shù)為89.27，且總平均親水性為-0.042。

運(yùn)用Scratch Protein Predictor 進(jìn)行 CoFAD2-1蛋白可溶性和二硫鍵預(yù)測(cè)分析。預(yù)測(cè)CoFAD2-1 蛋白不可溶的概率為0.779 307。該蛋白中的半胱氨酸的數(shù)量為7，二硫鍵總的個(gè)數(shù)為2，第一個(gè)二硫鍵的半胱氨位置可能是在94～106 上，第一個(gè)二硫鍵的半胱氨位置可能在239-252。

圖1 PCR 擴(kuò)增電泳圖Figure 1 The agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2.2 油茶CoFAD2-1 氨基酸序列同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在NCBI 網(wǎng)站上運(yùn)用BLAST 進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，確定克隆到的基因?qū)儆贔AD2 家族。其編碼區(qū)DNA 序列長(zhǎng)度為 1 149 bp。從 46 bp 到 328 bp 段有3 個(gè)峰，代表的是催化油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化必不可少的3 個(gè)保守性非常高的組氨酸跨膜結(jié)構(gòu)域。該區(qū)域包含8 個(gè)組氨酸殘基，其中攜帶鐵原子配體，是催化油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化過(guò)程中必不可少的部分。

將CoFAD2-1 核苷酸序列用Vector NTI 軟件翻譯成氨基酸序列后，在Pfam 上對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在CoFAD2-1 基因特有的3 個(gè)保守性非常高的組氨酸簇—HECGHHHRRHHHVAHH，在圖2 中用陰影表示。

運(yùn)用 MEGA 6 Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)（圖3），將克隆到的基因翻譯成的蛋白序列與其他相似性高的FAD2 進(jìn)行聚類分析。從CoFAD2-1 基因的系統(tǒng)樹(shù)可以看出，除去譚曉風(fēng)等[20]克隆的油茶CoFAD2-1，其中相似性最高的為珙桐（Davidia involucrata Baill.），油茶 CoFAD2-1 基因與油茶、珙桐、大豆、油橄欖等種子特異表達(dá)的FAD2基因聚在一類，推測(cè)該基因在種子中特異表達(dá)。

圖2 CoFAD2-1 氨基酸序列Figure 2 Amino acid sequence of CoFAD2-1

圖3 CoFAD2-1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of CoFAD2-1

2.3 油茶CoFAD2-1基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)以油茶EF1α 基因?yàn)閮?nèi)參，分析了CoFAD2-1 基因在根、莖、葉、胚中的表達(dá)情況。在不同組織中的表達(dá)情況分析結(jié)果表明（圖 4），CoFAD2-1 基因在根、莖、葉、胚 4 種組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，在胚中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量其次，在根和莖中幾乎不表達(dá)，其中，在胚中的相對(duì)表達(dá)量是根中的46 倍。因此，推測(cè)該基因?yàn)榉N子特異性表達(dá)基因。

2.4 CoFAD2-1基因在本生煙亞細(xì)胞定位分析

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入煙草表皮細(xì)胞中，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化了重組載體pGWB-35S-coFAD2-GFP 的煙草表皮細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中檢測(cè)到熒光（圖5），說(shuō)明目的CoFAD2-1 基因主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。結(jié)果顯示，具有GFP 標(biāo)簽的目的基因CoFAD2-1 熒光所示位置，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Marker 熒光表達(dá)位置重疊，說(shuō)明CoFAD2 基因定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。

圖4 不同組織中CoFAD2-1 基因相對(duì)表達(dá)量Figure 4 Relative expression of CoFAD2-1 gene in different tissues

圖5 CoFAD2-1 在煙草亞細(xì)胞定位Figure 5 The results of subcellular location of CoFAD2-1 in tobacco

3 討論與結(jié)論

FAD2 基因家族廣泛存在于植物界，目前已從許多植物中克隆到FAD2 基因，對(duì)于其功能的研究相對(duì)較明了，但有關(guān)油茶中FAD2 基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。FAD2 具有3 個(gè)組氨酸跨膜結(jié)構(gòu)域，從植物或微生物中分離或得到其蛋白較為困難[21]。經(jīng)油茶不同組織中CoFAD2-1 基因的表達(dá)量分析及系統(tǒng)樹(shù)聚類分析得出，該基因?yàn)榉N子中特異性表達(dá)的，由于在大多數(shù)物種中的種子特異表達(dá)的FAD2 都命名為FAD2-1，故將該基因命名為CoFAD2-1。經(jīng)Vector NTI 軟件比對(duì)，與譚曉風(fēng)等[20]從湘林1 號(hào)油茶的近成熟果實(shí)中克隆的FAD2-1 基因（登錄號(hào)：KJ995981）氨基酸相似性為99.2%，共有3 個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同，在湘林1 號(hào)中第61、234、235 氨基酸位點(diǎn)分別為纈氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，而在閩48 FAD2中分別為異亮氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。與王仲偉等[22]克隆到的 CoFAD2-2 基因（登錄號(hào)：JQ739518）核苷酸相似性為73.5%。CoFAD2-1 蛋白具有6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，煙草瞬時(shí)表達(dá)分析顯示該蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。

本文對(duì)油茶內(nèi)脂肪酸去飽和酶的不同組織的表達(dá)量進(jìn)行了分析，明確了其種子內(nèi)表達(dá)的特異性，并且進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，為后期進(jìn)行油茶品質(zhì)改良奠定了基礎(chǔ)。前人研究表明，環(huán)境脅迫能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成的改變以及細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化，脂肪酸去飽和酶能夠幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，有助于提高植物細(xì)胞對(duì)非生物脅迫的耐受性[23]。目前有關(guān)FAD2 的應(yīng)用主要是通過(guò)構(gòu)建種子特異性表達(dá)載體，將FAD2 反義基因轉(zhuǎn)入油料作物以提高其油酸含量，培育油酸含量高的品種[24]。