劉冠群，吳祠平，譚禮強(qiáng)，譚 杰，楊婉君，唐 茜*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.貴州省茶葉研究所，貴陽 550006；3.四川省雅安市名山農(nóng)業(yè)局，四川雅安 625100）

茶樹為多年生常綠木本植物，不論野生型或栽培型茶樹都屬于山茶屬（Camellia）茶組（Sect.Thea）各個(gè)種。中國是茶樹的原產(chǎn)地和茶的故鄉(xiāng)，起源于我國云南[1-2]，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于我國四川、云南、貴州等20 多個(gè)省市和地區(qū)。名山茶樹良種繁育場是四川最大的茶樹良種繁育場，截至2016年，有各類不同品種或品系達(dá)1 200 余份，且隨著茶樹的育種方式的不斷創(chuàng)新，越來越多的種質(zhì)資源得以收集和保存，為了保護(hù)我國這些特有和優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源，促進(jìn)資源的有效區(qū)分和合理利用，保障我國茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展，還需積極開展茶樹種質(zhì)資源的特異性鑒定和種質(zhì)識(shí)別技術(shù)研究。

SSR（simple sequence repeat），也稱微衛(wèi)星（microsatellite）。廣泛應(yīng)用于植物基因定位和QTLs 分析、DNA 指紋和品種鑒定、種質(zhì)資源保存和利用、系譜分析以及標(biāo)記輔助育種[3]。通常呈共顯性遺傳，其多態(tài)位點(diǎn)豐富，實(shí)驗(yàn)操作簡單易行。近年來SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在植物不同品種身份鑒定取得了可喜的進(jìn)展。邱楊等[4]利用22 對(duì)SSR 引物對(duì)75 份蘿卜材料鑒定，結(jié)果選用8 對(duì)引物將完全區(qū)分開并建立了分子身份證。黃丹娟[5]利用30 對(duì)SSR 引物研究了39 個(gè)茶樹品種，選用其中4 對(duì)可將所有品種區(qū)分開且構(gòu)建了分子二維碼。高源等[6]從32 對(duì)合成引物中篩選出16 對(duì)穩(wěn)定性高和重復(fù)性好的引物用于131份蘋果屬植物指紋圖譜構(gòu)建。張靖國等[7]用17 對(duì)多態(tài)性引物對(duì)20 個(gè)梨栽培品種進(jìn)行擴(kuò)增，建立了20個(gè)梨栽培品種的分子身份證。SSR 標(biāo)記法在植物品種身份鑒定上被廣泛應(yīng)用和接受，而在茶樹方面目前還未出臺(tái)該類似標(biāo)準(zhǔn)。本研究借鑒前人所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，首次嘗試對(duì)名山24 份具有代表性的茶樹種質(zhì)進(jìn)行分子身份證二維碼研究，結(jié)合被機(jī)器快速掃描的二維碼分子身份證，旨在為名山茶樹種質(zhì)資源有效保護(hù)、材料的快速鑒別提供有效的探索，以期正確反映或標(biāo)識(shí)四川省茶樹種質(zhì)的多樣性和特異性，促進(jìn)特異和優(yōu)異茶樹資源的有效鑒別與保護(hù)利用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

本試驗(yàn)選取24 份材料含有國家級(jí)良種、省級(jí)良種、地方品種見表1，是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院的研究人員于2016年9 月份在名山茶樹良種繁育場資源圃內(nèi)采集，每份茶樹種質(zhì)取10 株，選取嫩芽混合取樣，用錫箔紙包裹每份種質(zhì)材料，用記號(hào)筆編號(hào)立刻放入-196 ℃的液氮罐內(nèi)保存，帶回實(shí)驗(yàn)室并轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱。SSR 引物是根據(jù)已經(jīng)公布序列的引物挑選出（見表2）。

表1 供試茶樹材料名稱和原產(chǎn)地信息Table 1 Name and origin of evaluated samples

表2 篩選出的適合本研究7 對(duì)茶樹SSRTable 2 Selected 7 SSR primers used for the tea analyse

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取

使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DP305 植物基因組試劑盒主要參照天根試劑盒使用說明書方法提取茶樹新梢基因組DNA，先將提取出的DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，拖尾降解的DNA 將重新提取，完整性較好的DNA，使用核酸測定儀檢測DNA 濃度，后將每份樣品 DNA 稀釋到 25～30 ng/L 的濃度，并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)與聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR 反應(yīng)總體積為 15 μL，取 DNA 模板 2 μL，30 ng/μL，10 mmol/L 濃度的上下游引物各 0.3 μL，2.5 mmol/L 的 dNTPs 加 0.3 μL，10×PCR Buffer 加1.5 μL，1U Taq 酶，25 mmol/L MgCl2加 1 μL，后加超純?nèi)ルx子水補(bǔ)充值15 μL。PCR 擴(kuò)增程序[11]為：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)后，72 延伸 7 min，最后4 ℃保存。試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。擴(kuò)增在Bio-Metra 96 上進(jìn)行。點(diǎn)樣前加入3 μL 含量為1%的溴酚藍(lán)混勻，在含8% 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳檢測，電壓160 V，時(shí)間80 min，電泳儀為六一儀器廠的DYY-6C 型號(hào)，電泳槽為HTSCZ04 型號(hào)垂直電泳槽，電泳完后用銀染法洗條帶顯色，在觀片燈下用高清單反照相機(jī)拍照相并保存原始圖片（如圖1）。

圖1 篩選出的引物TM169 對(duì)24 份茶樹材料擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplified results of 24 tea cultivars with primer TM169

1.2.3 數(shù)據(jù)的處理和二維碼的轉(zhuǎn)換

將電泳圖譜上清晰可見帶型，根據(jù)擴(kuò)增的目的基因從大到小依次編排第一位點(diǎn)、第二位點(diǎn)、第三位點(diǎn)等，再根據(jù)位點(diǎn)分為 A/A、B/B、C/C、A/B、A/C、B/C 等不同的基因型，如表3 所示，將A/A 基因型記為 1、B/B 基因型記為 2，C/C 基因型記為 3、A/B 基因型記為 4、A/C 基因型記為5、B/C 基因型記為 6、A/B/C 記為7、無條帶的泳道讀為?/?并記為8、其他類型記為9。最后按照引物固定排列順序，串聯(lián)形成一組引物對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)（見表3），也就是該品種的分子身份證。將每份茶樹種質(zhì)所得的分子身份證號(hào)與茶樹名稱及其他信息相結(jié)合的方法，通過在線二維碼轉(zhuǎn)換器（https：//cli.im/）將表4 的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為分子數(shù)據(jù)二維碼（見圖3），所得二維碼就是早逢春等24 份不同茶樹品種的身份信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 24份茶樹種質(zhì)SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

經(jīng)過挑選8 份形態(tài)學(xué)差異較大的茶樹DNA 做模板，從51 對(duì)合成引物中篩選出7 對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性高、帶型清晰、重復(fù)試驗(yàn)均出現(xiàn)同樣帶型的引物，分別是 A18、A114、TM056、TM169、TM237、CsFM1058、CsFM1059。7 對(duì)引物在24 份種質(zhì)中共擴(kuò)增出154條譜帶，每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為3～5 個(gè)，平均 4 個(gè)；多態(tài)信息含量（PIC）最小為0.4，最大為0.7，平均多態(tài)信息含量為0.56，其中引物CSFM1058多態(tài)信息含量最低為0.4；引物A18 在這24 份材料擴(kuò)增的多態(tài)信息含量最高為0.7。

表3 不同基因型的編號(hào)Table 3 The code of different genotypes

表4 原始數(shù)據(jù)矩陣Table 4 The original data matrix

圖2 是基于Nei's 遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類圖，各品種基本按照遺傳背景聚類。根據(jù)上圖可知，紫嫣與其他品種在相似度為0.3 左右單獨(dú)分開，說明紫嫣是非常特殊品種與其他23 份茶樹存在著較大不同，中茶 108 與川沐29 等品種在相似度為0.89 聚在了一起，兩者的親緣關(guān)系比較相近。由來自云南省的兩個(gè)省的品種云梅和木蘭1 聚在了一起，福建省育成的黑旦與肉桂、黃玫瑰等，以及由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所育成的中茶108 和郁金香等，分別聚為不同的小類群；我國臺(tái)灣島的金萱與其他品種相似度相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.2 分子二維碼對(duì)茶樹種質(zhì)資源的保護(hù)

指紋圖譜代碼構(gòu)建方法參考邱陽和黃丹娟等[4-5]圖譜代碼構(gòu)建方法，簡化如下。對(duì)PCR 電泳圖進(jìn)行人工讀帶，同一引物擴(kuò)增出來的DNA 片段從大到小依次記錄，根據(jù)不同的位點(diǎn)的等位基因，分別標(biāo)為 A/A、B/B、C/C、A/B、A/C、B/C 等基因型。按照引物排 列 順 序 依 次 為 TM056、TM169、TM209、TM237、CSFM1599、CSFM1058、A18，建立起原始數(shù)據(jù)矩陣。（見表4）根據(jù)特征譜帶統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果將其轉(zhuǎn)換為阿拉伯?dāng)?shù)字串符，將字串符數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，要求任何兩個(gè)品種數(shù)字不重疊，即每份茶樹分子身份證號(hào)（見表5）。例如；歌樂茶的分子身份證號(hào)為4544515。再利用二維碼生成器將每份分子身份證號(hào)轉(zhuǎn)換成二維碼，即得到每份種質(zhì)的分子二維碼（見圖3）。該分子二維碼能夠被任何掃碼機(jī)器快速、準(zhǔn)確識(shí)破，并能夠快速顯示茶樹的身份信息，這對(duì)不同茶樹品種的鑒定與保護(hù)能夠提供可靠的依據(jù)。

圖2 參試材料UPGMA 聚類分析樹狀圖Figure 2 Dendrogram of tested materials using UPGMA clusteranalysis

表 5 7 對(duì)SSR 引物在24 個(gè)茶樹品種中多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 5 Amplification information of 7 primer pairs in 24 tea cultivar

3 討論與結(jié)論

DNA 分子指紋檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)植物新品種的快速鑒別[12]。我國目前僅有蘋果和玉米等頒布了DNA 指紋檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。茶樹品種鑒定DNA 指紋方法從表2 數(shù)據(jù)來看，單一的引物不足以區(qū)分這24個(gè)茶樹品種，TM056、TM169、TM209、TM237、CSFM 1599、CSFM1058、A18 這 7 個(gè)引物單獨(dú)鑒定品種能力各不相同，其中A18 在24 材料擴(kuò)能增出5 種不同等位基因型。基因型過多會(huì)為條帶統(tǒng)計(jì)降效果而增加負(fù)擔(dān)，利用不同引物組合則可以區(qū)分更多的茶樹品種。本研究將這7 對(duì)引物組合，根據(jù)劉峰等[13]提出核心引物理論上可鑒別區(qū)分的最大品種數(shù)的計(jì)算公式為N=G1×…×Gn，假如每對(duì)引物平均鑒定出4個(gè)不同等位基因，那么這7 個(gè)引物理論上可鑒定的最大品種數(shù)為47=16 384 個(gè)，理論上這7 對(duì)引物可以滿足現(xiàn)有茶樹PVP 申請(qǐng)品種鑒定的需要，本研究根據(jù)不同基因型構(gòu)建的分子身份證號(hào)能夠完全區(qū)分這24 份材料，但是，還有可能出現(xiàn)與這些材料相同基因型的材料，不足以區(qū)分所有的種質(zhì)材料，因此，應(yīng)根據(jù)茶樹連鎖遺傳圖譜相同連鎖群位置選擇備用引物，當(dāng)兩個(gè)品種分子身份證號(hào)完全相同時(shí)，可添加備用引物對(duì)其再次區(qū)分，以驗(yàn)證其存在明顯基因型差異。

圖3 24 份茶樹品種的分子二維碼Figure 3 The molecular qr codes of 24 tea cultivars

目前，我國茶樹新品種的鑒定與保護(hù)主要通過DUS 測試，但是由于茶樹的表型性狀易受外界條件的干擾，常常不能真實(shí)地反映基因型，預(yù)見性差。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在植物的不同發(fā)育階段、不同組織都可以進(jìn)行檢測，使得對(duì)基因型的早期選擇成為可能；不受環(huán)境影響；表現(xiàn)為共顯性遺傳，有利于對(duì)隱性基因的選擇；標(biāo)記數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。本研究構(gòu)建了24 份中國茶樹代表品種的分子身份證，并將其生成分子二維碼，這種二維碼分子身份證可以被任何掃碼機(jī)器解讀，快速地識(shí)別不同茶樹種質(zhì)身份信息，徹底擺脫人工讀取字串符的麻煩。

近年來，隨著四川省名山茶樹良種場收集各類優(yōu)質(zhì)資源力度加大，保存的不同種質(zhì)數(shù)量迅速增加。如何能夠快速準(zhǔn)確地判定同名異物或同物異名的茶樹材料，通過建立茶樹分子數(shù)據(jù)庫或分子身份信息識(shí)別平臺(tái)，對(duì)茶樹種質(zhì)資源的鑒定與保護(hù)具有廣闊的應(yīng)用前景。利用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建的分子身份證能夠正確反映或標(biāo)識(shí)茶樹種質(zhì)的真實(shí)性和特異性、有效地防止名山繁育場特有資源的流失提供依據(jù)和技術(shù)支持。

本研究依據(jù)引物擴(kuò)增的多態(tài)性信息含量和對(duì)茶樹種質(zhì)的區(qū)分率，從51 對(duì)SSR 引物中篩選出7對(duì)擴(kuò)增條帶清新的核心引物組合，區(qū)分24 份地方品種、省級(jí)良種及國家級(jí)良種種質(zhì)資源茶樹，并基于指紋圖譜的基因型構(gòu)建得身份證號(hào)，能被機(jī)器快速準(zhǔn)確識(shí)別的分子二維碼，為快速鑒定名山茶樹良種繁育場茶樹種質(zhì)資源和優(yōu)良品種保護(hù)提供了理論依據(jù)。