李敏 朱家勝

胃癌（GC）是全球最常見的消化道惡性腫瘤及癌癥相關(guān)死亡原因之一，其發(fā)病率、死亡率在惡性腫瘤中均排在前列。胃癌全球高發(fā)區(qū)主要集中在亞洲，而亞洲高發(fā)區(qū)又主要集中在日本及中國(guó)［1］。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)胃癌新發(fā)病例占全球胃癌發(fā)病的42.6%，盡管近年來(lái)有數(shù)據(jù)顯示胃癌死亡率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但其總體死亡率相比于歐美等國(guó)仍處于較高水平［2］。腫瘤的生長(zhǎng)離不開新生的脈管系統(tǒng)為其提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并帶走代謝產(chǎn)物，目前研究比較多的分子標(biāo)志物有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）家族和人表皮生長(zhǎng)因子（HER）/neu家族。VEGF-C和HER-2在腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移過程中作用顯著［3］。本文探討HER-2與VEGF-C在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與胃癌不同臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至5月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院胃腸外科61例擇期行開腹胃癌D2根治術(shù)患者手術(shù)標(biāo)本。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）于2010年頒布的第七版分期（TNM分期），Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例；女11例，男50例，年齡41～89歲。按年齡分為2組（≥60歲43例，＜60歲18例）；賁門及胃底18例，胃體20例，胃竇及幽門23例。

1.2 主要儀器及試劑 Pathcentre全自動(dòng)密封式脫水、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)、LeicARM2135切片機(jī)、WD900B格蘭仕微波爐、科龍BCD-272/HC電冰箱、即用型SP試劑盒、HER-2單抗體、VEGF-C單抗體、美國(guó)BioGenex全自動(dòng)免疫組化機(jī)、Olympus BX 40光學(xué)顯微鏡、DAB底物顯色劑、磷酸鹽緩沖液 PBS（0.01M，pH7.4）、單道可調(diào)式移液器、移液器吸嘴、實(shí)驗(yàn)沖洗瓶、孵育盒、耐高溫塑料染色架。

1.2 方法 （1）切片及光學(xué)顯微鏡診斷：①常規(guī)石蠟標(biāo)本切片：使用LeicA-RM2135切片機(jī)，將所有石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行切片。切片厚度為5μm。每例標(biāo)本制作2張切片。②上述每張標(biāo)本均行常規(guī)HE染色，按胃癌組織學(xué)分類、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（1981年WHO制定）進(jìn)行光學(xué)顯微鏡診斷。（2）HER-2/neu的測(cè)定（同VEGF-C的測(cè)定）：運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法測(cè)定HER-2/neu。具體操作方法：①脫蠟步驟：將組織片置入90℃溫箱中烘片20min后；經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別5min脫蠟；無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中梯度脫水1min；再取出并緩慢流水沖洗1min。②酶的封閉與抗原修復(fù)：用高壓鍋預(yù)熱pH8.0的EDTA抗原修復(fù)液至沸騰，放入切片，閉緊蓋子，大火加熱至噴氣開始計(jì)時(shí)2.5min；關(guān)閉火源靜置15min后流水沖洗壓力鍋10min冷卻至室溫；再經(jīng)3% H2O2過氧化氫孵育10min后移入PBS液中，套圈，PBS沖洗切片；PBS 沖洗4次，每5min/次。③免疫組化染色（機(jī)器操作部分）。④封片：取出切片，流水沖洗1min，無(wú)水乙醇1min，共3次；取出風(fēng)干，中性樹膠封片；鏡下觀察，判斷結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) （1）VEGF-C陽(yáng)性細(xì)胞判定：由兩位病理科專家獨(dú)立觀察10個(gè)高倍鏡視野，棕黃色顆粒染色定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)與胞膜染色。VEGF-C陽(yáng)性結(jié)果根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行綜合評(píng)分判定：①未見染色為0分，染色淡為1分，染色適中為2分，染色深為3分；②染色細(xì)胞數(shù)占所觀察視野細(xì)胞數(shù)≤5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。最終得分計(jì)算方法為：平均著色程度得分乘以平均著色細(xì)胞所占百分率。0～1分為陰性（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。（+）表示弱陽(yáng)性結(jié)果，（+++）表示強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果＞（++）判斷為VEGF-C陽(yáng)性。（2）HER-2陽(yáng)性細(xì)胞判定：由兩位主治以上職稱的病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察10個(gè)高倍鏡視野，棕黃色顆粒染色定位于細(xì)胞膜上。HER-2陽(yáng)性結(jié)果判定：①“0”（陰性）指細(xì)胞膜均無(wú)染色或≤10%腫瘤細(xì)胞膜染色；②“+”（陰性）指染色腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞膜不完整，弱染色；③“++”（不確定）指：染色腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞基底膜和側(cè)膜輕度至中度完整染色；④“+++”（陽(yáng)性）指：染色腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞膜基底膜和側(cè)膜完整，強(qiáng)染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)和Fisher檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-2陽(yáng)性檢出率與VEGF-C陽(yáng)性檢出率的比較 VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)與HER-2陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 HER-2陽(yáng)性檢出率與VEGF-C陽(yáng)性檢出率的比較

2.2 胃癌組織中HER-2、VEGF-C與患者各臨床特征的關(guān)系 見表2。

表2 胃癌組織中HER-2、VEGF-C與患者各臨床特征的關(guān)系

3 討論

胃癌在全球范圍內(nèi)無(wú)論是發(fā)病率還是死亡率均排在惡性腫瘤前列，是人類健康的重大威脅之一［4］。由于缺乏較完善的早期胃癌篩查指南，我國(guó)胃癌早期診斷率較低，多數(shù)胃癌確診時(shí)已處于進(jìn)展期，并發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)移。胃癌治療方式主要以手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療為主。

VEGF在胃癌組織中其表達(dá)率與各臨床特征之間的關(guān)系報(bào)道不盡相同。胃癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率約39.0%～59.4%［5］。本資料中，VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率為49.9%，與Xie LX等［6］用IHC法的結(jié)果報(bào)道較為接近。VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達(dá)顯著增高。但并不是所有的VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性的病例均發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，相反也并不是所有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)。作者認(rèn)為導(dǎo)致該結(jié)果的可能性一種是促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的途徑較多，VEGF-C并不是唯一一種促淋巴管生成因子；另一種可能是VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面無(wú)明顯促進(jìn)作用或作用微弱。本資料結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組胃癌組織中VEGF-C表達(dá)顯著增高與VEGF-C促進(jìn)淋巴管生成作用有關(guān)，VEGF-C促進(jìn)了淋巴管的形成，從而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移，但其卻不是唯一一種促進(jìn)淋巴管生成的因子。VEGF-C的高表達(dá)在臨床工作中對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)作用，而且在胃癌的治療、預(yù)后的判斷及監(jiān)測(cè)上幫助頗大。

Weiling He等［7］和Weiguo Cao等［8］的研究綜合臨床病理資料及隨訪研究發(fā)現(xiàn)，胃癌標(biāo)本中VEGF-C表達(dá)明顯增高者常預(yù)示胃癌病期晚、預(yù)后差、生存期短。本資料中Ⅱ期與Ⅲ期之間的結(jié)論與Weiling He等和Weiguo Cao等相符，其他各期之間需要進(jìn)一步增大樣本量研究才可得出結(jié)論。

HER家族在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移等方面作用顯著。各研究報(bào)道中免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中HER-2陽(yáng)性表達(dá)率在6.8%～34.0%［9］。較多報(bào)道稱HER-2表達(dá)陽(yáng)性率與胃癌分型（Lauren分型）有顯著相關(guān)性。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）于2014年公布的中國(guó)胃癌患者HER-2表達(dá)與病理分型關(guān)系顯示，HER-2表達(dá)陰性患者生存期最好，而彌漫型生存期最差。關(guān)于腫瘤位置與HER-2陽(yáng)性率的關(guān)系各方報(bào)道尚存在爭(zhēng)議，大部分學(xué)者報(bào)道其與位置無(wú)相關(guān)性［10］。

本資料，HER-2陽(yáng)性表達(dá)率為11.5%，與其他大部分研究報(bào)道相比陽(yáng)性率偏低。分析其原因可能為：本實(shí)驗(yàn)中選取病例61例，樣本量有限；實(shí)驗(yàn)過程中某些操作可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差；檢測(cè)技術(shù)的誤差，IHC檢測(cè)結(jié)果靈敏度不夠。HER-2陽(yáng)性表達(dá)率與上述臨床病理特征之間無(wú)明顯相關(guān)性，與大部分研究報(bào)道比較相符。關(guān)于其表達(dá)率與Lauren分型之間、及與預(yù)后的關(guān)系缺乏進(jìn)一步跟進(jìn)、隨訪資料，未能在該處得出結(jié)論。

胃癌的靶向治療已然成為當(dāng)前胃癌治療的熱點(diǎn)。HER-2與VEGF-C在胃癌組織中過表達(dá)對(duì)胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。有報(bào)道稱HER-2的過度表達(dá)通過一些特殊機(jī)制上調(diào)VEGF的表達(dá)水平，并且在HER-2過表達(dá)胃癌患者的治療中聯(lián)合抗HER-2和抗VEGF效果明顯好于單純抗HER-2治療［11］。假設(shè)兩者間確實(shí)存在必然聯(lián)系，將給胃癌的治療帶來(lái)更加有效的方法。本資料中未發(fā)現(xiàn)VEGF-C與HER-2之間的相關(guān)性，考慮可能與樣本量小有關(guān)，如繼續(xù)探究?jī)烧咧g的關(guān)系必須增大樣本含量，收集更多跟進(jìn)隨訪資料。