郝小吉，尚小娜,3，于海華，么建萍，韓璐，劉曉暉，李亞晨,#，邵靜,*

1. 大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大連市血液病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省造血干細(xì)胞移植醫(yī)學(xué)中心，遼寧省造血干細(xì)胞移植臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116044 2. 大連市婦幼保健院，大連 116033 3. 康龍化成(北京)新藥技術(shù)股份有限公司，北京 100176

六溴環(huán)十二烷(hexabromocyclododecane, HBCD)是一種高溴含量的脂環(huán)族添加型阻燃劑，與多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)均屬于溴系阻燃劑(BFRs)，作為PBDEs替代物被廣泛使用，同樣應(yīng)用于電子、電器、化工、交通、建材、紡織、石油和采礦等領(lǐng)域。與PBDEs類(lèi)似，HBCD易于從產(chǎn)品中游離、釋放到環(huán)境介質(zhì)中，具有持久性和蓄積性，從而成為一種新型環(huán)境有機(jī)污染物[1-2]。有研究認(rèn)為，HBCD可能與PBDEs形成復(fù)合污染體系，二者共同作用，對(duì)人類(lèi)健康造成潛在危害[3]。

HBCD毒性作用主要表現(xiàn)為肝臟損傷[4]、內(nèi)分泌干擾[5-6]和神經(jīng)毒性[7]等方面。尤其，處于腦發(fā)育期的嬰幼兒及兒童是HBCD及HBCD/PBDEs復(fù)合污染物暴露的高風(fēng)險(xiǎn)人群。HBCD誘導(dǎo)的發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)主要來(lái)源于神經(jīng)發(fā)育時(shí)期[8]。研究表明，HBCD引起發(fā)育神經(jīng)毒性的機(jī)制可能與2個(gè)因素有關(guān)：(1)引起腦局部神經(jīng)細(xì)胞損傷，而直接影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育；(2)通過(guò)影響腦局部甲狀腺激素水平，間接影響神經(jīng)發(fā)育水平，但二者的聯(lián)系機(jī)制尚不清楚。

機(jī)體不同組織細(xì)胞對(duì)甲狀腺激素的生理需求不同，需要對(duì)來(lái)自循環(huán)的甲狀腺激素在局部細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)，使組織局部甲狀腺激素并不完全依賴(lài)外周循環(huán)水平。組織中脫碘酶(deiodinase, Dio)對(duì)此起著關(guān)鍵作用。Dio是一組含硒蛋白酶，分三型(Dio1、Dio2和Dio3)，各自以獨(dú)特的脫碘方式調(diào)節(jié)其所分布組織細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素(thyroxine, TH)的生物活性。Dio2功能是通過(guò)外環(huán)脫碘在細(xì)胞內(nèi)將四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine, T4)轉(zhuǎn)化為活性三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)，并通過(guò)特異的T3受體發(fā)揮生物功能，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，是哺乳動(dòng)物胚胎中主要的脫碘酶[9]；在腦組織中，Dio2主要分布于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中[10-11]。Dio3主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞，特別是胎腦、1月齡以?xún)?nèi)的嬰兒皮膚、胎盤(pán)和胎兒腸組織中，是通過(guò)內(nèi)環(huán)脫碘將細(xì)胞外T4和T3分別轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的反三碘甲狀腺原氨酸(reverse triiodothyronine, rT3)和二碘甲狀腺原氨酸(diiodothyronine, T2)，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞內(nèi)T3水平，避免發(fā)育中的胎兒和胎兒組織暴露于高濃度活性甲狀腺激素中[11-12]。Dio1具有內(nèi)、外環(huán)脫碘的雙重活性，可在外周組織中清除rT3，并介導(dǎo)血清T3生成[13-14]。

作為環(huán)境有機(jī)污染物神經(jīng)毒性研究的一部分，本研究以人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-AS)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(H4)作為體外生物模型，初步探討HBCD對(duì)2種神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及對(duì)2種脫碘酶在不同細(xì)胞中表達(dá)特征的影響，明確Dio2和Dio3在HBCD誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的作用，以期探索孕期HBCD暴露是否通過(guò)影響胚胎腦局部脫碘酶表達(dá)、調(diào)控局部甲狀腺激素水平，進(jìn)而導(dǎo)致子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損傷。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與材料

HBCD(純度95%，美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司，北美)，DMEM低糖、高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，兔抗人多克隆抗體Dio2、Dio3及BDNF腦源生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒(Abcom公司，美國(guó))，Dio2和Dio3基因引物、RNA提取及反應(yīng)試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM( TaKaRa公司，日本)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染彩色蛋白分子量Maker、RIPA裂解液、四甲基乙二胺(TEMED)等(碧云天生物技術(shù)有限公司，北京)，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Proteintech公司，美國(guó))，ECL檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，氯仿、乙醇和異丙醇等均為分析純，分別購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司和天津市化學(xué)試劑一廠。SK-N-AS、H4細(xì)胞來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 3111，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，354型多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))，CKX41型倒置相差熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，電泳系統(tǒng)(EPS-300，上海天能)，梯度PCR儀(T100TM Thermal Cycler，美國(guó)Bio-RAD公司)，實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Takara Thermal Cycler Dice TP800，寶生物公司)，高速冷凍離心機(jī)(HERMLE公司，德國(guó))，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司，美國(guó))，Biodropsis超微量核酸分析儀(BD-1000，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)。

1.3 樣品采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)

將凍存的SK-N-AS、H4細(xì)胞復(fù)蘇，SK-N-AS用DMEM低糖培養(yǎng)基，H4用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中各加入10%的胎牛血清及1%的青-鏈霉素雙抗，將細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合將近80%時(shí)，用0.25%胰酶消化為細(xì)胞傳代，培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)換液，保證細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為8×104個(gè)·mL-1，鋪于96孔板底100 μL·孔-1，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～24 h，棄清液；加入不同濃度HBCD(0、1、3、9 μmol·L-1)，100 μL·孔-1，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱染毒24 h，棄清液；每孔加100 μL新鮮配制的MTT應(yīng)用液，繼續(xù)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2 h，棄清液；每孔加100 μL二甲基亞砜(DMSO)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中1 h，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)595 nm測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞在不同濃度下的存活率。保證實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性，結(jié)果重復(fù)3次以上。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)脫碘酶Dio2和Dio3基因表達(dá)

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SK-N-AS、H4細(xì)胞，分別用0、1、3和9 μmol·L-1HBCD處理24 h，用TransZol Up試劑盒提取總RNA，超微量核酸分析儀分析RNA的純度，保證無(wú)污染及降解。Dio2、Dio3以及GAPDH基因引物序列見(jiàn)表1。將1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的說(shuō)明操作，具體反應(yīng)步驟如下：首先去除基因組DNA(表2)，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(表3)，然后按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明，構(gòu)建qRT-PCR的反應(yīng)體系(表4)。反應(yīng)在八聯(lián)管中進(jìn)行，置于PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、30 s；95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40次；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s；每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照，檢驗(yàn)引物質(zhì)量。觀察目的基因的擴(kuò)增曲線及溶解曲線，需滿(mǎn)足特異性及靈敏性的要求，以GAPDH的表達(dá)量對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

表1 引物GAPDH、Dio2、Dio3的基本參數(shù)Table 1 Parameters of GAPDH, Dio2, Dio3 genes

表2 去除基因組DNA反應(yīng)Table 2 Reaction for eliminating the genomic DNA

1.3.4 Western Blot檢測(cè)Dio2和Dio3蛋白表達(dá)

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SK-N-AS、H4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)·mL-1，鋪于10 cm的培養(yǎng)皿中，分別用0、1、3、9 μmol·L-1HBCD處理24 h。(1)提取總蛋白及定量保存：用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白定量，用蛋白變性劑及煮沸的方法使蛋白變性。(2)電泳分離蛋白及免疫印跡：按表5分別配制12%分離膠和5%濃縮膠，上40 μg的蛋白樣品。電泳條件為恒壓100 V、90 min；根據(jù)預(yù)染彩色蛋白分子量Maker，切取所需的蛋白凝膠，采用槽式濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流220 mA、90 min。(3)封閉：5%脫脂奶粉封閉2 h。(4)孵育一抗：用1%的脫脂奶按1：400、1：200和1：1 000的比例分別稀釋Dio2、Dio3和β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。(5)孵育二抗：取一抗孵育的PVDF膜，搖床上TBST洗膜3×10 min，用1%的脫脂奶按1：2 000、1：3 000分別稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。(6)顯影：用TBST洗膜3×10 min，按ECL檢測(cè)試劑盒用UVP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Table 3 Reaction for reverse transcription

表4 qRT-PCR反應(yīng)體系Table 4 qRT-PCR reaction

1.3.5 HBCD對(duì)H4細(xì)胞BDNF分泌的影響

星形膠質(zhì)細(xì)胞(例如H4)分泌的生長(zhǎng)因子包含纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-6和BDNF等，不僅影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，還影響神經(jīng)元細(xì)胞的分裂、分化和遷移、樹(shù)突和軸突的生長(zhǎng)及突觸的生成等。其中，BDNF是一種促進(jìn)受損傷的神經(jīng)元再生及分化的營(yíng)養(yǎng)因子，在正常大腦中，介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞之間的相互影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)HBCD對(duì)H4細(xì)胞分泌BDNF水平的影響，即細(xì)胞上清液中BDNF含量，可初步了解在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中或體內(nèi)生理?xiàng)l件下，HBCD對(duì)2種細(xì)胞相互作用的改變。

具體方法：細(xì)胞經(jīng)0、1、3和9 μmol·L-1HBCD處理24 h后，收集細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)中結(jié)果穩(wěn)定且有意義的細(xì)胞上清液，保存于-80 ℃，用于檢測(cè)BDNF含量，上清經(jīng)2 000 r·min-1去除細(xì)胞碎片，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)染毒濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)均制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確計(jì)算上清中BDNF的含量。

表5 分離膠(12%)和濃縮膠(5%)的配制Table 5 Preparation of separation gel (12%) and stacking gel (5%)

注：SDS表示十二烷基硫酸鈉，APS表示過(guò)硫酸銨，TEMED表示N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

Note: SDS stands for sodium dodecyl sulfate; APS stands for ammonium persulfate; TEMED stands for N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，用Graph Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。用單因素方差分析(ANOVA test)進(jìn)行組間比較，方差不齊則用Dunnett’s T3直接進(jìn)行多重比較。*表示，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 HBCD對(duì)SK-N-AS細(xì)胞生存率及脫碘酶表達(dá)的影響

2.1.1 細(xì)胞生存率

人神經(jīng)元細(xì)胞SK-N-AS細(xì)胞分別暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)其存活率下降，并具有一定劑量依賴(lài)性。由圖1可知，與對(duì)照組比較，1、3和9 μmol·L-1HBCD染毒組細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的89%、76%和53%，其中3和9 μmol·L-1HBCD染毒組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 Dio3基因和蛋白表達(dá)

腦局部神經(jīng)元主要表達(dá)Dio3，因此，本研究考察HBCD對(duì)SK-N-AS細(xì)胞中Dio3基因和蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h后，用qRT-PCR法分析SK-N-AS中Dio3基因表達(dá)水平，由圖2可知，低劑量HBCD使Dio3表達(dá)略有下降，而高劑量(9 μmol·L-1)則引起Dio3表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

WesternBlot分析Dio3蛋白表達(dá)水平。由圖3可知，Dio3的蛋白表達(dá)水平變化與基因基本相似，低劑量組略有下降趨勢(shì)，而9 μmol·L-1組則明顯上調(diào)(P<0.05)。

2.2 HBCD對(duì)H4細(xì)胞生存率、脫碘酶表達(dá)和BDNF分泌的影響

2.2.1 細(xì)胞生存率

人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞H4細(xì)胞分別暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。與SK-N-AS細(xì)胞相似，H4細(xì)胞存活率下降，并具有一定劑量依賴(lài)性。由圖4可知，與對(duì)照組比較，1、3和9 μmol·L-1HBCD染毒組細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的～80%、69%和60%，其中3和9 μmol·L-1HBCD染毒組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 HBCD對(duì)SK-N-AS細(xì)胞Dio3基因表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of HBCD on Dio3 gene expression in SK-N-AS cells

圖3 HBCD對(duì)SK-N-AS細(xì)胞Dio3蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of HBCD on Dio3 protein expression in SK-N-AS cells

圖4 HBCD對(duì)H4細(xì)胞存活率的影響Fig. 4 Effect of HBCD on cell viability of H4 cells

2.2.2 Dio2基因和蛋白表達(dá)

腦局部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)Dio2，本研究考察HBCD對(duì)H4細(xì)胞中Dio2基因和蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，用qRT-PCR法分析H4細(xì)胞中Dio2基因表達(dá)變化。由圖5可知，HBCD引起基因表達(dá)下調(diào)，且具有劑量依賴(lài)性，其中，3和9 μmol·L-1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Western Blot分析H4細(xì)胞中Dio2蛋白表達(dá)水平。由圖6可知，HBCD對(duì)Dio2蛋白表達(dá)的影響與對(duì)基因表達(dá)影響一致，亦可引起蛋白表達(dá)下調(diào)，且具有劑量依賴(lài)性，其中，3和9 μmol·L-1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.3 對(duì)BDNF分泌的影響

H4細(xì)胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，ELISA分析細(xì)胞外BDNF蛋白含量，由圖7可知，HBCD暴露可致H4細(xì)胞分泌的BDNF蛋白明顯減少，其中，3和9 μmol·L-1HBCD組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

環(huán)境有機(jī)污染物對(duì)甲狀腺激素水平影響已成為發(fā)育神經(jīng)毒性研究的重點(diǎn)之一，甲狀腺激素對(duì)腦發(fā)育的影響逐漸受到重視。甲狀腺激素水平的相對(duì)穩(wěn)態(tài)主要是靠下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸(HPT軸)調(diào)控。HPT軸是一個(gè)復(fù)雜的甲狀腺激素(TH)代謝和作用調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，TH受體、脫碘酶、甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)和鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體被認(rèn)為是重要的功能基因參與TH合成、運(yùn)輸、代謝和發(fā)揮生物活性[15]，并且可能是暴露于環(huán)境污染物的生物體甲狀腺破壞的敏感分子生物標(biāo)志物[16-17]。

圖5 HBCD對(duì)H4細(xì)胞Dio2基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of HBCD on Dio2 gene expression in H4 cells

圖6 HBCD對(duì)H4細(xì)胞Dio2蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of HBCD on Dio2 protein expression in H4 cells

圖7 HBCD對(duì)H4細(xì)胞BDNF分泌的影響Fig. 7 Effect of HBCD on BDNF secretion in H4 cells

HBCD與PBDEs均具有內(nèi)分泌干擾作用，其中，孕期PBDEs對(duì)甲狀腺激素的干擾作用，已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)，主要表現(xiàn)為血液中T4濃度降低。脫碘酶是甲狀腺激素代謝中最重要的轉(zhuǎn)化酶，對(duì)維持機(jī)體甲狀腺激素水平起著決定作用。脫碘酶不僅參與甲狀腺激素的合成與活化，而且對(duì)甲狀腺功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。組織中脫碘酶對(duì)來(lái)自循環(huán)的甲狀腺激素在局部細(xì)胞中的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用。筆者課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，孕哺期BDE 209暴露能夠影響出生后子代甲狀腺激素脫碘酶基因的表達(dá)，同時(shí)伴有學(xué)習(xí)記憶能力下降[18]。由于HBCD與PBDEs和甲狀腺激素結(jié)構(gòu)不相似，因此，HBCD被認(rèn)為具有較低干擾甲狀腺軸的可能性。然而，最近研究表明，HBCD與PBDEs一樣可干擾生物體內(nèi)甲狀腺穩(wěn)態(tài)[5,19]，從而影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，特別是腦的正常發(fā)育。

研究證實(shí)，HBCD暴露能夠影響脫碘酶的活性和基因表達(dá)，從而干擾生物體內(nèi)甲狀腺穩(wěn)態(tài)。Palace等[20]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒魚(yú)用含HBCD飼料喂養(yǎng)32 d后，肝臟Ⅱ型外環(huán)脫碘酶活性顯著升高，而虹鱒魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)HBCD暴露后，血漿游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)和游離甲狀腺素(free tetraiodothyronine, FT4)水平改變，14 d后肝微粒體T4外環(huán)脫碘酶(T4ORD)活性未受到影響，但56 d后T4外環(huán)脫碘酶活性顯著降低。劉園園等[21]研究發(fā)現(xiàn)，腦發(fā)育期大鼠，經(jīng)HBCD暴露后，血清中總甲狀腺素(total tetraiodothyronine, TT4)、總?cè)饧谞钕僭彼?total triiodothyronine, TT3)、FT4、FT3濃度隨著暴露劑量增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并且肝臟D1活性及基因表達(dá)水平和腦D2活性及基因表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)。García等[22]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)T3和T4通過(guò)改變Ⅱ型脫碘酶活性影響脫碘作用的速度。此外，HBCD暴露可通過(guò)增強(qiáng)葡萄糖苷酸化來(lái)提高甲狀腺激素的分泌[23]，通過(guò)增強(qiáng)組織結(jié)合能力[24]或增強(qiáng)脫碘和消除作用[21]提高甲狀腺激素從循環(huán)中的攝取，這些都能影響循環(huán)甲狀腺激素的水平，繼而影響脫碘酶活性。這些研究顯示了HBCD對(duì)甲狀腺激素代謝過(guò)程影響的復(fù)雜性。HBCD暴露是直接影響脫碘酶轉(zhuǎn)錄或翻譯，還是通過(guò)改變外周甲狀腺激素水平間接影響脫碘酶尚不能確定。本研究中，筆者調(diào)查了HBCD對(duì)H4人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ⅱ型脫碘酶(Dio2)和SK-N-AS人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ⅲ型脫碘酶(Dio3)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，HBCD以劑量依賴(lài)方式降低H4細(xì)胞和SK-N-AS細(xì)胞生存率，引起H4細(xì)胞Dio2蛋白和基因表達(dá)下調(diào)，而致SK-N-AS細(xì)胞Dio3蛋白和基因表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示，HBCD可能通過(guò)抑制Dio2的表達(dá)，減少腦細(xì)胞內(nèi)由T4向T3的轉(zhuǎn)化，而通過(guò)增加Dio3的表達(dá)，將細(xì)胞外T4和T3分別轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的rT3和T2，從而使腦局部T3水平降低，影響腦發(fā)育。為明確HBCD對(duì)脫碘酶表達(dá)的影響是否對(duì)局部T3、T4水平有干擾作用，本研究試圖檢測(cè)SK-N-AS和H4這2種細(xì)胞上清液中T3、T4和rT3含量，但由于體外表達(dá)和分泌量很低，檢測(cè)結(jié)果非常不穩(wěn)定，筆者課題組未來(lái)將在體內(nèi)研究中探討HBCD對(duì)脫碘酶以及T3、T4的毒理學(xué)效應(yīng)。

另外，值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，HBCD對(duì)SK-N-AS中Dio3表達(dá)具有濃度效應(yīng)，在低濃度下致Dio3表達(dá)略有下降，盡管未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在高濃度下則致Dio3表達(dá)顯著增高。Dio3是細(xì)胞表面受體，環(huán)境有機(jī)污染物在低濃度下對(duì)其RNA或蛋白表達(dá)影響不明顯，但可能通過(guò)氧化應(yīng)激、經(jīng)由其他生物分子而改變Dio3結(jié)構(gòu)和功能，從而影響局部甲狀腺激素水平[25-27]。而在高濃度下，環(huán)境有機(jī)毒物可能通過(guò)甲基化或microRNA調(diào)控Dio3表達(dá)，影響局部組織甲狀腺激素水平，從而可能引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷[28]。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在TH介導(dǎo)的腦發(fā)育中起關(guān)鍵作用[29]。在腦發(fā)育中，BDNF廣泛涉及神經(jīng)元增殖和分化[30]，特別是BDNF促進(jìn)神經(jīng)突遷移和伸長(zhǎng)[31]。此外，小鼠BDNF基因缺失顯示的腦發(fā)育異常類(lèi)似于甲狀腺功能減退的動(dòng)物[32]。BDNF表達(dá)在甲狀腺機(jī)能減退的小鼠中也受到抑制[33]。Ibhazehiebo等[34]報(bào)道BDNF能緩解HBCD引起的甲狀腺激素誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞軸突延長(zhǎng)抑制。因此，本研究初步探討HBCD對(duì)H4細(xì)胞BDNF分泌的影響，結(jié)果顯示，HBCD可以降低H4細(xì)胞BDNF的分泌，而B(niǎo)DNF降低，很可能加劇HBCD對(duì)神經(jīng)元的損傷，或阻礙神經(jīng)元的修復(fù)和再生過(guò)程。筆者課題組今后將在SK-N-AS和H4這2種細(xì)胞共培養(yǎng)體系以及在體內(nèi)研究中，進(jìn)一步探討B(tài)DNF和其他生長(zhǎng)因子在HBCD神經(jīng)毒性中的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，HBCD暴露可能通過(guò)影響胚胎腦局部脫碘酶表達(dá)、調(diào)控局部甲狀腺激素水平，影響B(tài)DNF的分泌，導(dǎo)致子代神經(jīng)發(fā)育異常。下一步將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究孕期HBCD暴露對(duì)胚胎腦局部脫碘酶表達(dá)的影響及甲狀腺激素水平的調(diào)控，以闡明HBCD引起子代神經(jīng)發(fā)育毒性的機(jī)制。