肖福龍 宮麗鴻 姜 丹

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

近年來，人們認(rèn)識(shí)到整個(gè)冠狀動(dòng)脈循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能，包括微循環(huán)和心外膜冠狀動(dòng)脈，均會(huì)影響患者的癥狀和預(yù)后。與冠脈微循環(huán)相關(guān)的疾病即為冠脈微循環(huán)障礙（CMD）。有充分證據(jù)表明［1］血管內(nèi)皮功能障礙是CMD的重要原因。研究表明［2］急性心肌梗死再灌注可誘導(dǎo)內(nèi)皮屏障功能發(fā)生障礙，造成冠狀微循環(huán)損傷。前期研究表明搜風(fēng)祛痰中藥具有改善內(nèi)皮功能等作用［3-4］。因此本研究采用缺血再灌注模型從內(nèi)皮屏障角度觀察中藥對(duì)于缺血再灌注模型大鼠冠脈微循環(huán)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體質(zhì)量為（240±20）g的SPF級(jí)雄性SD大鼠140只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供［許可證號(hào)：SYXK（遼）2013-0009］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 搜風(fēng)祛痰中藥：陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù) 15 g，全蝎5 g，蜈蚣 1條，地龍 20 g，水蛭15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液備用。培哚普利片［8 mg/片，施維雅（天津）制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20103382］。

1.3 試劑與儀器 前列環(huán)素、血栓素A2（TXA2）試劑盒（AMEKO）；柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒（Sangon Biotech）；BioEasy Master Mix試劑盒（博日科技）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme）；微量核酸蛋白測(cè)定儀（BioDrop）；PCR擴(kuò)增儀（GeneAmp）；熒光定量PCR儀（Agilent Technologies）

1.4 分組與造模［5］將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、培哚普利組、搜風(fēng)祛痰中藥組4組，每組35只。將雄性SD大鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉注射，氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)，于左側(cè)第3～4肋間切開皮膚，鈍性分離肌層，打開胸腔，充分暴露心臟，用帶線縫合針在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間于左心耳根部下方約2 mm處進(jìn)針，將左前降支連同少量的心肌組織一起結(jié)扎，用血管鉗夾緊閉合胸腔，實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠呼吸、心率變化。手術(shù)過程嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。缺血30 min，再灌注120 min，制備大鼠心肌缺血再灌注模型。結(jié)扎成功的標(biāo)志為心電圖顯示ST段抬高，計(jì)時(shí)心肌缺血30 min末剪斷結(jié)扎線，再灌注時(shí)長(zhǎng)為120 min，恢復(fù)冠脈血流，抬高的ST段下降1/2以上為大鼠心肌缺血再灌注模型造模成功。

1.5 給藥方法 根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與大鼠體質(zhì)量折算系數(shù)6.3折算成大鼠用量后給藥。其中假手術(shù)組、模型組大鼠予以生理鹽水10 mL/kg灌胃；搜風(fēng)祛痰中藥組大鼠予以搜風(fēng)祛痰中藥8.1 g/kg灌胃（前期研究結(jié)果）［6］；培哚普利組予以培哚普利片0.4 mg/kg灌胃。建立心肌缺血再灌注模型1 h前給予藥物治療，假手術(shù)組與其他3組手術(shù)過程相同，但不結(jié)扎。

1.6 標(biāo)本采集 造模成功后進(jìn)行取材，取材前夜禁食，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置后離心，取上清液-20℃保存?zhèn)溆?；取血結(jié)束后即刻處死大鼠，無(wú)菌條件下取出心臟，經(jīng)多聚甲醛固定，置于液氮中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 指標(biāo)檢測(cè) 1）心電圖。將大鼠用水合氯醛麻醉后，仰臥固定在手術(shù)板上，頭頸部自然伸直并固定，確定各電極位置后將電極插入相應(yīng)大鼠皮膚內(nèi)，分別于大鼠造模缺血時(shí)、再灌注時(shí)進(jìn)行心電圖檢測(cè)。2）ELISA法：檢測(cè)TXA2、前列環(huán)素（PGI2）含量，具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。3）RT-PCR法：測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）mRNA，利用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立熒光PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。EPCR引物序列：上游為 5′-GCAAAACACCAAAGGGAGCC-3′，下游 為 5′-ACAGCCCATCAGGATACCCA-3′，長(zhǎng)度為 70 bp。TM引物序列：上游為5′-TGAGTGCAGTCAAGGCGAAT-3′，下游為5′-GAACAGGGATGGGGTCACAG-3′，長(zhǎng)度為128 bp。進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。各組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 大鼠情況 注射麻醉藥物后大鼠死亡3只，手術(shù)過程中假手術(shù)組死亡10只，造模過程中死亡38只?？傆?jì)造模成功42只（模型組16只、培哚普利組12只、搜風(fēng)祛痰組14只）、假手術(shù)組25只。

2.2 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組PGI2含量降低、TXA2含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，培哚普利組和搜風(fēng)祛痰中藥組PGI2含量均增高、TXA2含量均降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組培哚普利組搜風(fēng)祛痰中藥組n 25 16 12 14 PGI2 68.484±1.95 32.44±1.918*58.257±5.934△54.507±5.351△TXA2 35.141±0.711 62.258±5.785*42.471±1.012△49.514±3.426△

2.3 各組大鼠TM、EPCR mRNA表達(dá)水平比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TM、EPCR mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，培哚普利組和搜風(fēng)祛痰中藥組大鼠均能降低TM、EPCR mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。

3討論

PCI后出現(xiàn)無(wú)復(fù)流、慢復(fù)流是其嚴(yán)重并發(fā)癥，這種現(xiàn)象會(huì)加重患者死亡風(fēng)險(xiǎn)［7］。發(fā)生原因主要是PCI后容易發(fā)生微血管栓塞和微血管功能改變，冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊的破裂、斑塊碎片、微栓子、中性粒細(xì)胞-血小板聚集物導(dǎo)致冠脈微循環(huán)栓塞或再灌注血流引起氧自由基增多等損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞加重微循環(huán)障礙［8］。因此可從保護(hù)內(nèi)皮屏障角度論治冠脈微循環(huán)障礙。冠脈微循環(huán)是由心臟前小動(dòng)脈（100～400 μm）、壁間小動(dòng)脈（＜100 μm）和冠狀毛細(xì)血管床（＜10 μm）構(gòu)成［9］，當(dāng)冠脈微循環(huán)系統(tǒng)受到一種或多種不良因素影響出現(xiàn)異常后即發(fā)生冠脈微循環(huán)障礙［10］。

表2 各組大鼠TM、EPCR mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠TM、EPCR mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組培哚普利組搜風(fēng)祛痰中藥組n 25 16 12 14 TM mRNA 1.005±0.0849 3.629±0.427*1.935±0.127△2.71±0.0656△EPCR mRNA 1.006±0.161 9.192±0.231*1.642±0.282△1.925±0.191△

目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏明確安全且有效的干預(yù)冠脈微循環(huán)障礙藥物，中醫(yī)藥為冠脈微循環(huán)障礙的治療提供了新思路。CMD這一病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可以歸屬到中醫(yī)學(xué)“胸痹”等病。宮麗鴻教授認(rèn)為患者運(yùn)動(dòng)減少，飲食膏粱厚味致使脾虛生痰，痰凝血瘀，痰瘀蘊(yùn)結(jié)不解而生內(nèi)癰毒熱，熱極生內(nèi)風(fēng)，風(fēng)邪為百病之長(zhǎng)，善行而數(shù)變，痰風(fēng)內(nèi)動(dòng)［11］，筋脈失養(yǎng)，攣急剛勁，與冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)病機(jī)制血栓阻塞、血管痙攣有相似之處，故以“風(fēng)痰理論”為基礎(chǔ)，予以搜風(fēng)祛痰中藥，方中全蝎息風(fēng)止痙通絡(luò)散結(jié)；蜈蚣息風(fēng)止痙、通絡(luò)止痛；地龍息風(fēng)止痙、平喘通絡(luò)；白術(shù)、法半夏、陳皮合用，既可寬胸理氣，又可燥濕化痰；水蛭破血逐瘀通經(jīng)，共奏搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)之效。藥理方面，全蝎、蜈蚣、地龍具有抗血小板聚集、抗凝、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、改善血液流變學(xué)指標(biāo)等作用［12-15］，陳皮能抗血栓、抗炎、抗氧化、降血脂等作用［16］。

培哚普利片是長(zhǎng)效的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可促進(jìn)病變的冠狀小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)修復(fù)，故選擇培哚普利片作為陽(yáng)性對(duì)照藥物［17］。TM和EPCR屬于糖蛋白，均位于內(nèi)皮細(xì)胞膜上，可反映內(nèi)皮屏障損傷，對(duì)維持微血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用［18］。缺血再灌注損傷時(shí)由于缺血缺氧等因素可造成心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，屏障功能受損［19］，引起血管通透性增加，導(dǎo)致微血管功能障礙。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TM、EPCR mRNA表達(dá)水平升高，說明冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生時(shí)內(nèi)皮屏障受到損傷。與模型組比較，搜風(fēng)祛痰中藥可降低TM、EPCR mRNA表達(dá)，說明搜風(fēng)祛痰中藥具有保護(hù)內(nèi)皮屏障作用。TXA2和PGI2可由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成［20-21］，屬于血管活性物質(zhì)。PGI2與平滑肌上的IP受體結(jié)合具有強(qiáng)烈的舒張血管作用，TXA2具有收縮血管作用，PGI2和TXA2之間的平衡對(duì)冠脈微血管的收縮和舒張有著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：模型組PGI2含量下降，TXA2含量升高，表明微血管收縮與舒張物質(zhì)失衡。與模型組比較，搜風(fēng)祛痰中藥通過調(diào)節(jié)血管收縮和舒張活性物質(zhì)之間的平衡，改善微血管痙攣，增加心肌供血，改善受損內(nèi)皮屏障功能從而達(dá)到修復(fù)心肌微循環(huán)目的。

綜上所述，搜風(fēng)祛痰中藥可降低TM、EPCR mRNA表達(dá)水平，降低TXA2含量、升高PGI2含量，從保護(hù)內(nèi)皮屏障功能角度調(diào)節(jié)冠脈微循環(huán)可能是其治療冠脈微循環(huán)障礙的機(jī)制之一。搜風(fēng)祛痰中藥具體如何發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮屏障作用，還需要進(jìn)一步研究。