駱長永 李 雁△ 李 昕 梁 旭 楊潤宇 吳元德 王 欣

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京市通州區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京101100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730；4.廣東駿豐頻譜股份有限公司，廣東 廣州 510000）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由多種肺內(nèi)原因（如肺炎、誤吸等）或肺外疾?。ㄈ缒摱景Y、胰腺炎、創(chuàng)傷）引起，以進(jìn)行性低氧血癥、呼吸窘迫為特征的臨床危重癥。盡管其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但炎性細(xì)胞失控活化，進(jìn)而造成廣泛的內(nèi)皮屏障損傷，在發(fā)病過程中起關(guān)鍵的作用；導(dǎo)致炎性細(xì)胞失控活化的重要原因之一是促炎因子與抑炎因子表達(dá)失衡，這一點已為學(xué)術(shù)界所公認(rèn)［1］。ARDS的治療以保護(hù)性機(jī)械通氣、限制性液體管理等支持治療和控制原發(fā)病為主，無特異性治療方法，病死率仍在40%以上［2］。因此，迫切需要在對ARDS的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探討的基礎(chǔ)上，尋找安全、有效的治療方法。益氣化瘀解毒方是由首都國醫(yī)名師、北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院杜懷棠教授提供的經(jīng)驗方。杜懷堂教授是本課題組的指導(dǎo)老師，研究采用的益氣化瘀解毒方的劑型、用量等均得到了杜老師的認(rèn)可。前期動物實驗顯示［3-5］，益氣化瘀解毒方可減少白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等蛋白的表達(dá)，以及降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá)，證明益氣化瘀解毒方可通過降低促炎因子表達(dá)及抑制促炎通路活化，起到保護(hù)肺組織的作用。頻譜水是一種經(jīng)過超低頻電磁場處理后的功能水，即將普通飲用水的物理化學(xué)特性改變，如更小的水分子團(tuán)簇，更高的介電常數(shù)［6］，安全沒有毒害作用，并且可以提高免疫系統(tǒng)功能［7］。本研究通過觀察益氣化瘀解毒方、頻譜水對ARDS大鼠血清重要抑炎因子IL-4、IL-10表達(dá)水平的影響，探討益氣化瘀解毒方、頻譜水調(diào)控ARDS炎性反應(yīng)的機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠36只，（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），8周齡，體質(zhì)量（200±10）g。飼養(yǎng)于實驗動物中心屏障實驗室（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院），實驗室溫度設(shè)置為22～24℃，濕度固定在50%～70%，且給予相同標(biāo)準(zhǔn)的普通顆粒飼料，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再進(jìn)行實驗。本次實驗動物研究已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會審批。

1.2 試劑與儀器 益氣化瘀解毒方：黃芪30 g，黃芩10 g，金銀花15 g，三七10 g，赤芍15 g，炒枳實12 g，葶藶子15 g，桑白皮15 g。藥物由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，并制作成中藥浸膏，批號為20170320。大腸桿菌脂多糖（LPS）（美國Sigma公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號110M4086V）100 mg；IL-4 ELISA試劑盒（美國Abcam公司生產(chǎn)，批號A100770）；IL-10 ELISA試劑盒（美國Abcam公司生產(chǎn)，批號A1000776）；PBS溶液（美國Sigma公司）。精密電子天平；藥物天平HC·TP11·10（上海精密儀器儀表有限公司）；BH2生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；切片機(jī)EICA（德國LEICA公司）；高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；超低溫冰箱702（美國Thermo公司）。頻譜水治療儀JF-118B（廣東駿豐頻譜股份有限公司）。

1.3 分組及造模 將36只實驗動物隨機(jī)分為6組，每組6只，即空白對照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、頻譜水組，分別稱質(zhì)量并記錄。采用的ARDS動物模型為一次尾靜脈注射LPS誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)所致。全身炎癥反應(yīng)是引起ARDS最主要的病因，模型滿足ARDS肺組織病理特點，造模方法穩(wěn)定，學(xué)術(shù)界認(rèn)可。第7天灌胃后6 h，空白對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，2 mg/kg體質(zhì)量，其余各組予LPS溶液一次性尾靜脈注射，2 mg/kg體質(zhì)量。取材前8 h大鼠禁食水。

1.4 給藥方法 將制備好的中藥浸膏配置成不同濃度的中藥溶液，結(jié)合既往實驗研究，中藥低劑量組按6.1 g/（kg·d）（給藥劑量為生藥劑量），即成人3倍，中藥中劑量組按12.2 g/（kg·d）（給藥劑量為生藥劑量）予益氣化瘀解毒方溶液灌胃給藥，即成人6倍，中藥高劑量組按24.4 g/（kg·d）（給藥劑量為生藥劑量）給藥，即成人12倍。空白對照組、模型組按每日灌胃量為1 mL/100 g灌服蒸餾水，頻譜水組每日灌胃量為1 mL/100 g灌服超低頻電磁場處理水，連續(xù)灌胃或灌水7 d，頻譜水組日常飲用超低頻電磁場處理水，余各組均正常飲食水；以上藥物均由蒸餾水配制，配置藥液及蒸餾水均存放于4℃冰箱中，灌胃前用60℃溫水浴熱后再灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）肺大體。造模16 h后各組全部麻醉下取材，用精密天平稱質(zhì)量，記錄，置于操作臺，肉眼觀察并記錄肺臟的淤血程度、腫大程度、被膜色澤等病理變化，用數(shù)碼攝像機(jī)拍照記錄。2）肺組織病理。取右下肺進(jìn)行HE染色病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察以下指標(biāo)：大鼠肺泡間隔變化，炎癥細(xì)胞浸潤程度，肺毛細(xì)血管充血水腫狀況等組織形態(tài)學(xué)變化。經(jīng)組織切片、常規(guī)脫蠟、蘇木素染色、分色、脫水、封片等步驟，在顯微鏡下觀察各組肺組織病理情況。肺組織病理切片及HE染色于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理室制作完成。3）酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清IL-4、IL-10表達(dá)水平。取腹主動脈血3～5 mL于肝素化的試管中，經(jīng)3 000 r/min低溫離心20 min后，取血清置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒操作說明進(jìn)行測定。檢測IL-4表達(dá)水平時，將血清樣本PBS稀釋5倍后測定。檢測IL-10表達(dá)水平時，將血清樣本PBS稀釋8倍后測定。

表1 各組處理方法一覽表

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 計量數(shù)據(jù)以（）表示，使用Graphpad Prism7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，利用單因素方差分析（ONA-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性檢驗。各組間兩兩比較時先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗，滿足方差齊性時釆用LSD-t檢驗，不滿足方差齊性時釆用Dunnetts-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠肺大體觀察結(jié)果比較 見圖1?？瞻讓φ战M大鼠肺臟紅潤有光澤，無腫脹，切面無滲血、滲液；模型組大鼠肺臟體積明顯增大，肺組織明顯水腫，顏色暗紅，表面可見散在的大小不等的暗紅色斑片狀的出血點；各治療組大鼠肺臟腫脹不同程度減輕，體積增大，顏色淡紅，可見少量出血點，切面少量淡紅色液體滲出。

2.2 各組大鼠肺組織病理觀察結(jié)果 見圖2?？瞻讓φ战M大鼠的肺組織病理：肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡間隔無水腫，肺泡腔內(nèi)未見組織液，肺組織中未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠的肺組織病理：肺泡及肺間質(zhì)水腫并有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚并可見肺泡腔縮小變形，部分肺泡塌陷，支氣管腔和肺泡腔可見大量分泌物，內(nèi)含紅細(xì)胞，肺毛細(xì)血管充血水腫；各治療組大鼠的肺組織病理，較模型組損傷程度減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞塌陷較少，出血、滲出較少，肺微血管內(nèi)皮水腫較輕。

圖1 各組肺大體情況

圖2 各組肺組織病理情況（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠血清IL-4、IL-10表達(dá)水平比較 見表2。與空白對照組比較，大鼠血清中IL-4表達(dá)水平在模型組中顯著降低（P＜0.01）；各治療組大鼠血清IL-4表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.01），中藥各組中中藥中劑量組IL-4表達(dá)水平最高，頻譜水組與中藥中劑量組升高水平相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明中藥干預(yù)ARDS模型大鼠，可升高其大鼠血清中IL-4蛋白表達(dá)水平，頻譜水可以起到與中藥相近的干預(yù)效果。與空白對照組比較，大鼠血清IL-10在模型組表達(dá)水平升高（P＜0.01）；中藥低劑量組較模型組降低；中藥中劑量組、中藥高劑量組、頻譜水組血清IL-10表達(dá)水平均高于模型組（P＜0.01），中藥中劑量組較其他各治療組升高水平最為顯著。說明中藥中、高劑量干預(yù)ARDS模型大鼠可提高其血清中IL-10蛋白表達(dá)水平，頻譜水可升高IL-10蛋白表達(dá)水平，中藥中劑量干預(yù)效果最為顯著。

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-10表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-10表達(dá)水平比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白對照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組頻譜水組n 6 6 6 6 6 6 IL-4（pg/mL）62.43±4.20 15.10±4.40**28.33±3.45△△34.20±4.12△△28.31±5.15△△34.98±3.02△△IL-10（ng/mL）0.83±0.24 1.67±0.14**1.12±0.06△△3.13±0.13△△2.74±0.11△△2.58±0.08△△

3討論

3.1 IL-4、IL-10在ARDS發(fā)病中的作用 炎癥級聯(lián)反應(yīng)是ARDS發(fā)病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，根據(jù)細(xì)胞因子在急性呼吸窘迫綜合征中的作用不同可分為促炎因子和抑炎因子，促炎與抑炎的失衡是炎癥細(xì)胞失控活化的重要原因。大量的實驗和臨床證據(jù)也證明，促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子在急性呼吸窘迫綜合征的疾病發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。ARDS患者肺部炎癥反應(yīng)的復(fù)雜性，通過單一的細(xì)胞因子檢測難以獲得可靠的結(jié)果，必須在促炎和抑炎平衡的背景下加以理解［8］。IL-4由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子。IL-4可抑制促炎因子IL-1、TNF-α的表達(dá)，在ARDS發(fā)病過程中，被認(rèn)為是一種保護(hù)性抑炎因子?；罨姆闻菥奘杉?xì)胞可分為兩種主要表型：M1和M2巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞有助于組織修復(fù)，由于它們的抗炎作用，通過釋放Th2細(xì)胞因子如IL-10、IL-13等發(fā)揮生物學(xué)功能［9］。IL-10主要為單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在較小程度上由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。該細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中具有多效性作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10在ARDS患者的第1天達(dá)到峰值，并且在第21天緩慢下降到檢測不到的水平，IL-10濃度的觀察結(jié)果提示ARDS發(fā)作時有顯著的抗炎作用［8］。早期ARDS患者支氣管肺泡灌洗液中的抗炎細(xì)胞因子IL-10濃度的降低與預(yù)后不良密切相關(guān)。提示增加抗炎細(xì)胞因子將是對ARDS患者有益的治療方法［10］。本次實驗結(jié)果顯示IL-10在模型組較正常組顯著升高，并不符合IL-10在模型組降低的預(yù)期。結(jié)合以上文獻(xiàn)，IL-10在ARDS發(fā)病中可能早期升高，后逐漸減低，仍可說明IL-10的抗炎作用以及其減低將預(yù)示患者預(yù)后不佳。

3.2 益氣化瘀解毒方及超低頻電磁場處理水的作用機(jī)理分析 中醫(yī)以臨床證候為出發(fā)點，針對病因病機(jī)進(jìn)行辨證論治。Meta分析顯示，中西醫(yī)結(jié)合治療ARDS較西醫(yī)常規(guī)治療在降低病死率等方面，有明顯優(yōu)勢［11］。ARDS患者多以感受邪毒，壅滯于肺，灼傷氣陰，瘀血內(nèi)停，致肺氣虛衰，肺氣衰敗，氣機(jī)逆亂而發(fā)?。?2-13］。本實驗采用的益氣化瘀解毒方是由杜懷堂教授提供的經(jīng)驗方，其組成為黃芪、金銀花、黃芩、三七、赤芍、桑白皮、葶藶子、炒枳實。杜懷堂教授認(rèn)為，其中黃芪為君，補(bǔ)肺氣以扶正，金銀花、黃芩為臣清肺熱以解毒，三七、赤芍為臣化瘀血以通絡(luò)，桑白皮、葶藶子、炒枳實共為佐藥瀉肺平喘，通腑理氣，全方以益氣扶正為主，兼以解毒化瘀，使肺氣得振，毒熱得解，喘促則息。因此，本團(tuán)隊經(jīng)過前期動物實驗驗證了益氣化瘀解毒方對促炎因子及其通路的抑制作用［3-5］，結(jié)合益氣化瘀解毒方“扶正祛邪”的治療原則以及中藥復(fù)方多成分、多靶點的作用機(jī)制，本次實驗證明了益氣化瘀解毒方可升高血清IL-4、IL-10的表達(dá)水平，共同證明益氣化瘀解毒方可能通過調(diào)控促炎因子與抑炎因子表達(dá)平衡，達(dá)到防治肺組織損傷的作用。頻譜水是具有特殊物理化學(xué)性質(zhì)的一種特殊處理水。動物實驗研究表明，頻譜水可以改善血流動力學(xué)指標(biāo)，改善微循環(huán)，同樣具有抗氧化、提高免疫系統(tǒng)的功能等作用。頻譜水對正常張力性青光眼等微循環(huán)減少的疾病有較顯著的改善作用［14］。超低頻電磁場處理水在一定程度上可改善胰島素抵抗大鼠血脂水平，也可以降低高脂飲食引起的肝功能紊亂程度［15］。研究顯示［3］，頻譜水可減低ARDS模型大鼠血清中IL-8、TNF-α的表達(dá)水平。本次實驗結(jié)果顯示，頻譜水可升高ARDS模型大鼠血清中IL-4、IL-10的表達(dá)水平，說明頻譜水對促炎因子與抑炎因子平衡系統(tǒng)具有一定的調(diào)控作用。

綜上所述，經(jīng)益氣化瘀解毒方、頻譜水治療后，模型大鼠肺臟腫脹程度、表面色澤、出血點等情況均有減輕，肺組織病理出血、水腫程度改善，炎性細(xì)胞滲出減少。除中藥低劑量組外，各治療組干預(yù)ARDS模型大鼠，可升高其大鼠血清中IL-4、IL-10蛋白表達(dá)水平，中藥中劑量干預(yù)效果最為顯著，頻譜水可以起到與中藥相近的干預(yù)效果。因此，益氣化瘀解毒方對LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠具有保護(hù)作用，可能與通過升高血清中抑炎因子IL-4、IL-10表達(dá)水平有關(guān)；超低頻電磁場處理水治療有升高抑炎因子表達(dá)水平、減輕肺組織損傷作用。