鄒學(xué)紅 汪 俊 王 芳 謝 環(huán)

（湖北省武漢市漢陽(yáng)醫(yī)院，湖北 武漢 433000）

急性盆腔炎（APID）是指女性內(nèi)生殖器及盆腔腹膜等部位的炎癥性疾?。?］，主要表現(xiàn)為慢性下腹痛、嘔吐、惡心、月經(jīng)紊亂等癥狀，且由于該病炎癥擴(kuò)展范圍不同，患者臨床表現(xiàn)并不完全一致［2］。APID炎癥嚴(yán)重者可引發(fā)感染性休克、彌漫性腹膜炎等并發(fā)癥。NLRP3炎癥小體參與多種炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）前體轉(zhuǎn)化為有活性的IL-1β，使其加重炎癥反應(yīng)。張強(qiáng)等研究報(bào)道NLRP3炎癥小體在腎臟炎癥損傷早期過(guò)程發(fā)揮重要作用［3］。研究報(bào)道，抑制NLRP3的表達(dá)，可減弱慢阻肺、心肌損傷等疾病中的炎癥反應(yīng)，但關(guān)于NLRP3在APID中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道［4］。金剛藤顆粒具有解熱清毒、抗菌消腫的作用，可用于盆腔炎等婦科疾病的治療［5］。本研究采用金剛藤顆粒治療APID大鼠，探究其對(duì)大鼠NLRP3炎癥小體及免疫功能的影響，以期為臨床治療APID的機(jī)制提供更多的思路?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SD大鼠105只由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2014-0004，使用許可證號(hào)SYXK（鄂）2014-0013，體質(zhì)量200～220 g。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)定飼養(yǎng)，大鼠自由飲水，保持室內(nèi)通風(fēng)良好，光照時(shí)間為8∶00～20∶00，溫度為18～28℃，濕度為40%～70%。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。金剛藤顆粒購(gòu)于廣西潤(rùn)達(dá)制藥股份有限公司，批號(hào)Z20030062；十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛、DEPC水購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司；IL-1β，IL-18 ELISA試劑盒購(gòu)于北京全式金生物有限公司；Anti-NLRP3、Anti-IL-1β、Anti-Caspase-1、Anti-ASC、Anti-β-Actin購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)于上海容創(chuàng)生物科技有限公司；蘇木素、伊紅染液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Genecopoeia公司。2）儀器。低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Heraeus公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購(gòu)于上海普赫生物科技有限公司；微量移液槍、離心機(jī)、勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf，GIS-500凝膠成像儀購(gòu)于Miulab公司；超低溫冰箱購(gòu)于日本Sanyo公司；電泳儀購(gòu)于賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.3 模型制備 取15只大鼠作為對(duì)照組，不進(jìn)行模型制備，其余90只大鼠制備APID模型［6］，50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹部剃毛、常規(guī)消毒，腹部正中切口3 cm，使用眼科手術(shù)器械打開腹腔，暴露子宮，4號(hào)頭皮針在子宮分叉處右側(cè)朝卵巢方向進(jìn)針，緩慢勻速注入25%苯酚膠漿0.05 mL，對(duì)側(cè)子宮不注射作自身對(duì)照，注射完畢后，分層關(guān)腹，消毒，消毒紗布覆蓋。APID模型制備過(guò)程中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。保留15只大鼠只進(jìn)行開腹和關(guān)腹手術(shù)，不注射苯酚膠漿為假手術(shù)組。

1.4 分組與干預(yù) APID大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組及金剛藤顆粒低、中、高劑量組（分別含原生藥8.1 g/kg、40.5 g/kg、81.0 g/kg），陽(yáng)性對(duì)照組（羅紅霉素82.74 mg/kg），每組均15只。分組后對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水100 mL/kg，金剛藤顆粒溶解后灌胃治療，每日1次，連續(xù)15 d。實(shí)驗(yàn)期間常規(guī)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的精神狀態(tài)、體質(zhì)量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 灌胃15 d后，次日清晨處死大鼠，打開腹腔，腹主動(dòng)脈采血，取血3 mL，室溫避光靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血清置于-20℃冰箱中保存待測(cè)。1）ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-1β，IL-18水平。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。2）大鼠病理形態(tài)學(xué)觀察。打開腹腔，摘取雙側(cè)子宮，肉眼觀察子宮色澤、彈性、化膿及周圍組織是否粘連。觀察完畢后將大鼠部分子宮組織置于-80℃冰箱保存，部分組織于4%多聚甲醛溶液中固定，子宮組織切成5 μm的切片，蘇木精-伊紅（HE）進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察子宮組織的病理形態(tài)。3）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平。取凍存的各組織標(biāo)本并按照Trizol試劑盒（Fermenas公司）說(shuō)明書提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 mL：SYBR GreenⅠqPCR Master Mix 12 mL，上下游引物各1 mL，cDNA模板1 mL，ddH2O 10 mL。其中引物合成見(jiàn)表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；48 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，以 GADPH 為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt算法計(jì)算NLRP3、ASC、IL-1、Caspase-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物信息見(jiàn)表1。4）Western blotting檢測(cè)子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)水平：取出液氮中凍存的子宮組織剪切50～100 mg制備組織勻漿，蛋白裂解液反應(yīng)30 min，提取總蛋白；BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS變性蛋白；SDS-PAGE電泳跑膠，蛋白上樣量為20 μg，電泳結(jié)束后切除目的條帶凝膠，目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4℃進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)1 h，后用TBST清洗；5%脫脂奶封閉1 h，TBST洗3×5 min，一抗（NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1抗體，稀釋倍數(shù)1∶1 000）4℃過(guò)夜，TBST洗3×5 min；IgG二抗（稀釋倍數(shù)1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗3×5 min；ECL顯色液顯色，凝膠成像儀觀察蛋白表達(dá)情況，Image J進(jìn)行目的條帶的灰度光密度分析，以β-Actin為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)量資料多組間對(duì)比采用單因素方差分析，兩兩對(duì)比采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物信息

2結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮肉眼觀察的比較 對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠行為、精神狀態(tài)、飲食均正常，大鼠子宮大小、顏色、形態(tài)正常，觸摸發(fā)現(xiàn)子宮硬度正常，漿膜面未見(jiàn)明顯腫脹出血；模型組大鼠子宮末端膨大，管腔擴(kuò)張迂曲，管壁變薄，管腔可見(jiàn)黃色膿液或者清涼液體，漿膜面明顯腫脹、充血，盆腔臟器粘連充血；金剛藤顆粒各組子宮腫脹、充血減輕，陽(yáng)性對(duì)照組與金剛藤顆粒高劑量組無(wú)顯著差異。

2.2 各組大鼠子宮病理學(xué)比較 見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、假手術(shù)組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞脫落壞死，腔壁結(jié)構(gòu)紊亂，全層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有充血水腫，符合APID臨床病變。金剛藤顆粒治療組、陽(yáng)性對(duì)照組較模型組有顯著改善，表明金剛藤顆粒對(duì)APID大鼠有良好的治療效果。

圖1 各組大鼠子宮病理學(xué)觀察（HE染色，10倍）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 見(jiàn)表2。ELISA檢測(cè)顯示，假手術(shù)組血清IL-1β、IL-18水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異，模型組血清IL-1β、IL-18水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽(yáng)性對(duì)照組IL-1β、IL-18水平較模型組顯著降低（P＜0.05），且金剛藤高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明金剛藤顆粒治療效果顯著。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，◇P＜0.05；與金剛藤低劑量組比較，※P＜0.05；與金剛藤中劑量組比較，#P＜0.05。下同

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組n 15 15 15 15 15 15 15 IL-1β 16.23±4.02 16.41±3.98 8.26±9.55*△40.59±8.62*△◇30.18±7.22*△◇※19.13±6.16◇※#18.24±6.21◇※#IL-18 20.34±5.61 20.16±5.41 70.16±11.54*△53.16±9.64*△◇38.16±9.16*△◇※24.56±7.41◇※#23.21±7.26◇※#

2.4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較 見(jiàn)表3。mRNA檢測(cè)顯示，假手術(shù)組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異，以下均在假手術(shù)組的基礎(chǔ)上進(jìn)行比較，模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽(yáng)性對(duì)照組各指標(biāo)水平較模型組顯著降低（P＜0.05），且金剛藤顆粒高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 1.03±0.04 1.01±0.05 5.26±0.52△4.59±0.32△◇3.18±0.22△◇1.23±0.12△◇1.18±0.08△◇ASC 1.04±0.03 1.06±0.02 4.46±0.54△3.16±0.37△◇2.38±0.26△◇1.16±0.14△◇1.11±0.09△◇IL-1β 0.97±0.02 0.99±0.01 6.11±0.48△4.39±0.42△◇2.38±0.20△◇1.10±0.16△◇1.08±0.13△◇Caspase-1 1.03±0.03 1.06±0.04 3.76±0.44△2.56±0.31△◇2.09±0.21△◇1.16±0.13△◇1.14±0.11△◇

2.5 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較 見(jiàn)圖2，表4。蛋白檢測(cè)顯示，假手術(shù)組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異，模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽(yáng)性對(duì)照組各指標(biāo)水平較模型組顯著降低（P＜0.05）。

3討論

圖2 大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白檢測(cè)

表4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較（±s）

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 0.23±0.04 0.25±0.05 0.84±0.05△0.57±0.03△◇0.39±0.04△◇0.33±0.05△◇0.31±0.07△◇ASC 0.34±0.03 0.26±0.03 0.91±0.04△0.76±0.05△◇0.58±0.04△◇0.46±0.05△◇0.41±0.04△◇IL-1β 0.17±0.02 0.19±0.05 0.81±0.03△0.69±0.04△◇0.60±0.05△◇0.51±0.07△◇0.46±0.03△◇Caspase-1 0.22±0.03 0.26±0.04 0.89±0.08△0.76±0.07△◇0.59±0.05△◇0.46±0.03△◇0.38±0.05△◇

近年來(lái)盆腔炎發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量及身心健康。盆腔炎的發(fā)生多因?yàn)楫a(chǎn)后感染、盆腔周圍炎癥擴(kuò)散等。APID多是由于致病微生物入侵生殖系統(tǒng)，引起生殖道及周圍組織的炎癥反應(yīng)［7］。APID治療前必須確定致病菌，再對(duì)癥下藥。目前治療APID常使用抗生素，青霉素可治療革蘭氏陽(yáng)性菌、敏感性葡萄球菌等，但容易引起抗藥性；四環(huán)素主要針對(duì)衣原體、支原體感染［8］。雖然西醫(yī)治療效果良好，但易引起不良反應(yīng)及抗藥性，故本研究采用中藥治療APID大鼠，分析其治療效果及作用機(jī)制。

本研究采用灌注25%苯酚膠漿制備APID大鼠模型，造模15 d后處死大鼠肉眼觀察模型組大鼠子宮末端膨大，漿膜面明顯腫脹、充血，HE染色模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞脫落壞死，腔壁結(jié)構(gòu)紊亂，全層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有充血水腫，表明APID大鼠造模成功。以往研究表明APID容易引起大鼠炎性浸潤(rùn)及內(nèi)膜充血水腫［9］，進(jìn)一步研究顯示血清IL-1β、IL-18水平顯著升高，表明大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

APID在中醫(yī)范疇屬于帶下痛經(jīng)，可通過(guò)降低炎癥感染的發(fā)生率來(lái)對(duì)癥治療［10］。金剛藤顆粒主要成分為金剛藤，其含有氨基酸、有機(jī)酸、皂基、生物堿等多種活性物質(zhì)，具有活血化瘀、清熱解毒之功效［11］。且金剛藤顆粒對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌均具有較好的拮抗作用，可通過(guò)使用金剛藤顆粒起到抗感染的作用［12］。本研究顯示與模型組比較金剛藤顆粒治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠子宮組織癥狀有一定改善，HE染色顯示子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均得到改善，且IL-1β、IL-18水平降低，表明金剛藤顆粒能夠降低大鼠炎癥反應(yīng)。

病原菌入侵機(jī)體后可被機(jī)體免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體（PRR）識(shí)別出來(lái)，引起機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起組織器官的免疫損傷［13］。NOD樣受體（NLR）是細(xì)胞內(nèi)重要的PRR，NLRP是NLR的一個(gè)亞家族，可活化組裝進(jìn)而形成炎癥小體，從而誘導(dǎo) IL-1β、IL-18等促炎因子的釋放［14］。炎癥小體由NLR、接頭蛋白ASC、效應(yīng)蛋白Caspase-1組成［15］。研究報(bào)道NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)無(wú)活性的IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子的分泌；其還可通過(guò)NLRP3-ASC-Caspase-1炎癥小體誘導(dǎo)Caspase-1的活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β的活化［16-17］。研究報(bào)道，心肌損傷組織中NLRP3炎癥小體通路大量激活［18］。NLRP3炎癥小體在全身炎性反應(yīng)綜合征中參與肺組織損傷［19］。燙傷小鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體通路大量激活，抑制NLRP3炎癥小體通路，可明顯減輕心肌損傷［20］。本研究中APID模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表達(dá)高于對(duì)照組，金剛藤顆粒治療后NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1顯著降低，表明NLRP3炎癥小體通路與APID損傷相關(guān)，金剛藤顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制NLRP3炎癥小體通路發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，金剛藤顆粒對(duì)APID大鼠炎癥損傷具有一定的保護(hù)作用，其可能通過(guò)NLRP3炎癥小體通路抑制炎癥反應(yīng)，本研究為APID的治療提供一定的理論參考，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。